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流感病毒基因序列變異的NGS監(jiān)測方法
流感病毒感染包括人類在內(nèi)的許多鳥類和哺乳動物，并且由這些病毒引起的感染具有重大的公共衛(wèi)生，動物衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)意義。甲型流感病毒（IAV）在遺傳和抗原上都極為多樣化，并廣泛分布于的野生禽類，家禽和哺乳動物以及人類中。有兩種主要的表面糖蛋白，血凝素和神經(jīng)氨酸酶，具有多種亞型。在144種可能的HA-NA亞型組合中，至少有131種已在NCBI流感病毒數(shù)據(jù)庫中從禽類中分離出來的菌株中進(jìn)行了確認(rèn)。對流感的監(jiān)測，快速診斷，傳播，發(fā)病機(jī)制和疫苗學(xué)的持續(xù)研究對于預(yù)防和減輕其影響至關(guān)重要。
流感研究的一個關(guān)鍵方面是檢測流感病毒的類型，亞型和基因型，并對其進(jìn)行分類，特別是對于不同樣本（例如野生鳥類，家畜和人類患者）中新出現(xiàn)的病毒變異要進(jìn)行監(jiān)測，預(yù)防和治療。技術(shù)進(jìn)步允許開發(fā)新的方法來鑒定來自各種樣品類型的流感病毒分離株，包括基于培養(yǎng)，抗體結(jié)合，血清學(xué)測定，基因擴(kuò)增和基因測序方法。比較全面的檢測方法仍然是采用高通量測序技術(shù)。由于典型臨床樣品中病毒RNA的數(shù)量較低，所有這些研究都采用了病毒特異性引物和病毒特異性PCR擴(kuò)增策略來捕獲目標(biāo)流感序列。然而近在下一代測序（NGS）中越來越多地強(qiáng)調(diào)PCR引入的錯誤。目前已經(jīng)顯示常用的PCR酶，包括高保真酶，均具有10-5至10-6點(diǎn)突變/ bp /重復(fù)的錯誤率。除了特征明確的聚合酶堿基取代錯誤外，還發(fā)現(xiàn)其他錯誤同樣普遍，包括PCR介導(dǎo)的重組，模板轉(zhuǎn)換和溫度循環(huán)過程中引入的DNA損傷。使用PCR捕獲源自流感病毒RNA的cDNA的另一個挑戰(zhàn)是分離的流感RNA可能已被降解，因此難以通過需要全長片段作為模板的流感通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。在許多場合下，無法使用亞型特異性引物，因?yàn)闃悠分辛鞲胁《镜念愋突騺喰褪俏粗摹?/p>
美國NIH設(shè)計(jì)了一種針對所有流感病毒株的捕獲探針。利用所有可用的甲型，乙型和丙型流感病毒序列，獲得了用于設(shè)計(jì)通用流感捕獲探針集。但探針捕獲的前提是需要有足夠的cDNA才可以實(shí)現(xiàn)，同時避免使用PCR引入的錯誤。 因此，美國NIH采用了Nugen公司的Ovation RNA-seq V2試劑盒來富集病毒的cDNA。 該試劑采用了Ribo-SPIA技術(shù)，只需4.5小時，即可從500 pg-100 ng的 總RNA中獲得高質(zhì)量的cDNA樣品。對于降解的樣本（如RIN 2.4）的樣本，同樣會給出驚喜的結(jié)果。Ovation RNA-Seq System V2以簡化的工作流程提供了更高的轉(zhuǎn)錄本覆蓋和均一的測序序列分布。 SPIA技術(shù)是取代PCR擴(kuò)增的一種技術(shù)，其原理是單引物的擴(kuò)增， 同時擴(kuò)增保證每次的模板是樣品模板，不同于PCR擴(kuò)增模板可能是上一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物。 SPIA擴(kuò)增產(chǎn)物無偏向，可用于基因表達(dá)差異分析，因此可呈現(xiàn)樣品的原始比列狀態(tài)。將該方法應(yīng)用于從野鳥場監(jiān)視收集的泄殖腔拭子樣品中，發(fā)現(xiàn)這些樣品中的IAV序列和亞型是傳統(tǒng)方法無法檢測到的。
隨后，NIH使用病毒靶向雜交捕獲對來自接受GMP制成的A型流感/加利福尼亞/ 04/2009（H1N1）攻擊的15位志愿者和5位2009年大流行的自然感染流感患者的鼻洗樣本進(jìn)行了深度測序。在挑戰(zhàn)病毒中發(fā)現(xiàn)了十個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位置。在攻擊患者和自然感染患者中發(fā)現(xiàn)了許多SNP位點(diǎn)，其中許多以前未發(fā)現(xiàn)。鑒定出的SNP和進(jìn)化樹分析表明，在挑戰(zhàn)參與者和自然感染的患者中病毒的宿主內(nèi)部進(jìn)化是不同的。這項(xiàng)研究使用PCR Free的雜交捕獲技術(shù)，提供了一種準(zhǔn)確無偏的評估方法，用于評估人體內(nèi)從統(tǒng)一的流感接種劑到宿主體內(nèi)不同病毒的進(jìn)化，并與自然感染的患者進(jìn)行比較。