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KAPA在Illumina測序平臺上進(jìn)行靶向重測序而制備
閱讀：2067 發(fā)布時間：2020-3-30點擊藍(lán)字關(guān)注我們
KAPA hgDNA定量&QC試劑盒，包含人類基因組DNA樣品NGS文庫構(gòu)建前，所有基于qPCR定量及質(zhì)量評估的試劑。
KAPA hgDNA定量&QC試劑盒，是基于SYBR Green I染料法優(yōu)化的高質(zhì)量qPCR檢測試劑盒，包含KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix預(yù)先稀釋的一系列DNA標(biāo)準(zhǔn)品，以及針對于人類基因組單拷貝的高度保守區(qū)域的不同位點所設(shè)計的引物預(yù)混液。小片段所對應(yīng)的引物，用于獲得定量的結(jié)果，而額外的引物，用于獲得在DNA樣本中可擴(kuò)增模板量(質(zhì)量高的DNA片段)的信息。這個試劑盒由此所產(chǎn)生的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(即Q-ratios)，可以用于預(yù)測文庫的產(chǎn)量，或者對于如FFPE DNA這類樣本質(zhì)量變化很大的樣本的工作流程進(jìn)行調(diào)整。
產(chǎn)品特色
在單次檢測中，同時評估樣本量以及樣本質(zhì)量
可以將質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Q-ratios)與測序相關(guān)指標(biāo)相關(guān)聯(lián)
高性能的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix
預(yù)先稀釋好的DNA標(biāo)準(zhǔn)品以及可以直接使用的引物
多功能、易于自動化的工作流程
建立樣本質(zhì)量控制中低條件
指示樣品是否有足夠的量以及質(zhì)量來成功構(gòu)建文庫
未通過質(zhì)控的樣本，不再進(jìn)行后續(xù)文庫構(gòu)建以及測序步驟，從而節(jié)約時間和精力
通過檢測進(jìn)行測序的樣本 (Sequenced Sample) 和Q值不夠、未進(jìn)行測序的樣本(QNS，Not Sufficient) 各自的Q-ratios。
數(shù)據(jù)來源于Dartmouth-Hitchcock醫(yī)療中心(DHMC)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗室。在DNA抽提后以及文庫構(gòu)建之前，使用KAPA hgDNA定量&QC 試劑盒，可以幫助使用者建立一個額外的質(zhì)量控制流程，用于在早期的過程中預(yù)測測序的質(zhì)量。DHMC在其擴(kuò)增子測序工作流程中，根據(jù)經(jīng)驗，使用Q129/41 bp>0.5和Q305/41 bp > 0.2作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。
分析NGS文庫構(gòu)建工作流程
Q-ratios可以幫助判斷NGS文庫構(gòu)建工作流程中的瓶頸
對于FFPE樣本，文庫質(zhì)量和測序中質(zhì)量的主要限制因素是：起始DNA轉(zhuǎn)化成連接有接頭的文庫分子的轉(zhuǎn)化率不高
文庫的轉(zhuǎn)化率，為在Illumina測序平臺上進(jìn)行靶向重測序而制備
分別從樣本質(zhì)量參差的80-100 ng FFPE DNA樣本(橙色)和商用人類基因組DNA(灰色)，使用KAPA LTP文庫構(gòu)建試劑盒來構(gòu)建測序文庫。FFPE DNA樣本在用Covaris打斷之前，用KAPA hgDNA定量&QC試劑盒進(jìn)行檢測，然后按照Q-ratios(DNA質(zhì)量)沿X軸升序排列。Q-ratios如圖中標(biāo)注。片段化的DNA(平均大小在180 bp左右)在建庫之前，用Qubit® HS dsDNA (Life Technologies) 進(jìn)行定量；在連接接頭、形成文庫分子之后，使用基于qPCR的KAPA文庫定量試劑盒進(jìn)行定量。結(jié)果顯示，F(xiàn)FPE樣本的文庫轉(zhuǎn)化率(Conversion Rate，起始DNA分子轉(zhuǎn)化成連接有接頭的文庫分子的百分比，%)明顯低于高質(zhì)量的DNA樣本，使得FFPE樣本的文庫分子多樣性受到限制，并且需要在文庫擴(kuò)增步驟中采取更多的循環(huán)數(shù)才能得到足夠多的文庫分子進(jìn)行靶標(biāo)捕獲，從而使FFPE樣本的文庫的重復(fù)率(duplication rate) 更高，靶標(biāo)覆蓋率(target coverage)更低。
從FFPE DNA樣本中獲得樣本制備的可操作數(shù)據(jù)
Q129/41 比值和測序中的關(guān)鍵指標(biāo)（如重復(fù)率）具有相關(guān)性
從250 ng Covaris打斷的FFPE DNA樣本(n=14)和對照組DNA(分別從培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮冰凍樣本和血液中提取，n=6)，進(jìn)行手動文庫構(gòu)建。樣本按照Q129/41-比例升序在x軸上從左至右排列(FFPE樣本用黃色表示，對照組DNA用橙色表示)。文庫構(gòu)建采用的是NEBNext® 試劑(New England Biolabs)，其中靶標(biāo)捕獲前和靶標(biāo)捕獲后的擴(kuò)增環(huán)節(jié)(10個循環(huán))采取KAPA HiFi 試劑盒。靶標(biāo)捕獲使用的是定制的SeqCap EZ panel (300 genes,0.9 MB)。 在Illumina HiSeq平臺上進(jìn)行了測序(2 x 100 bp)。FFPE樣本的平均靶標(biāo)覆蓋率(藍(lán)色點)是對照組的四倍(1,247X, vs. 301X)，平均重復(fù)率(紅色點)是對照組的兩倍(75% vs. 38%)。Q129/41 比值 > 0.4 的FFPE樣本所產(chǎn)出的文庫能夠達(dá)到低測序質(zhì)量要求。
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