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詳細(xì)介紹
實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性定量方法，已得到，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測(cè)序——>測(cè)序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實(shí)物保存。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
腸集聚性大腸桿菌(EAEC)核酸檢測(cè)試劑盒 | PCR檢測(cè)試劑盒 | 50T |
下列相關(guān)產(chǎn)品：
小鼠A(VA)PCR檢測(cè)試劑盒 50T
Rat osteonectin (ON) 大鼠骨粘連蛋白(ON)PCR檢測(cè)試劑盒
HumanCCAAT/enhancerbindingproteinalpha,C/EBPαELISAKit 人CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)PCR檢測(cè)試劑盒 50T 進(jìn)口分裝
ChickenLeinizingHormone,LHPCR檢測(cè)試劑盒雞促黃體激素(LH)PCR檢測(cè)試劑盒
載玻片細(xì)胞NFKAPPABP50蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測(cè)試劑盒10/20次
MouseFre
PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4：PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
定量PCR方法：
a、競(jìng)爭(zhēng)法 產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
大鼠淀粉樣蛋白β1-42(Aβ1-42)ELISA試劑盒 ，英文名： Aβ1-42 ELISA Kit
Ierleukin 1 soluble receptor I (IL-1sR I) of rat ELISA Kit 大鼠白介素1可溶性受體Ⅰ(IL-1sRⅠ)ELISA試劑盒
Ratmaixmetalloproteinase1,MMP-1ELISAkit 大鼠基質(zhì)金屬1(MMP-1)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
CLIAKitforCyt-CELISAKit大鼠規(guī)格：48T/96T
細(xì)胞色素P450亞酶3A4(TESTOSTERONE)活性高效液相色譜法(HPLC)定量檢測(cè)試劑盒20次
RatGamma-aminobyricacid,GABAELISAKit大鼠γ氨基(GABA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
小鼠可溶性血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1(sLOX-1)ELISA試劑盒 ，英文名： sLOX-1 ELISA Kit
大鼠粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)ELISA檢測(cè)試劑盒RatGranulocyteColonyStimulatingFactor,G-CSFELISAKit 96T/48T
人登革熱抗體(DF-Ab)免疫試劑盒 Human dengue fever aibody,DF-Ab ELISA Kit
RatorphaninFQ/nociceptin,OFQ/NELISAKit大鼠孤腓肽(OFQ/N)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
Formolsublimate固著液50毫升
MouseskeletalmuscleActinin-α,smActinin-αELISA試劑盒小鼠橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白α(smActinin-α)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
腸集聚性大腸桿菌(EAEC)核酸檢測(cè)試劑盒Anti-Synapsin II /FITC 熒光素標(biāo)記神經(jīng)突觸素2抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
HIV-1(gp41) 艾滋病病毒(抗原)Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
P選擇素抗體 Anti-P-selectin 0.1ml
SATB1 英文名稱： 核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白1抗體 0.1ml
Escherichka coli K99 英文名稱： 豬源產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌K99抗體 0.2ml
Rhesus antibody Rh Phospho-Met(Tyr1349) 0酸化肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(原癌基因)抗體 規(guī)格 0.1ml
HIV-1(gp41) 艾滋病病毒(抗原)Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
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