化工儀器網(wǎng)
詳細介紹
實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性定量方法，已得到，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測序——>測序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫——>質(zhì)粒實物保存。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
草魚出血熱病毒(GCHV)核酸檢測試劑盒 | PCR檢測試劑盒 | 50T |
下列相關(guān)產(chǎn)品：
小鼠硒蛋白M(SELM)PCR檢測試劑盒 ，英文名： SELM
小鼠角化細胞內(nèi)分泌因子(KAF)/雙調(diào)蛋白(AR)ELISA檢測試劑盒Mousekeratinocyteaocrinefactor/Amphiregulin,KAF/ARELISAKit 50T
人核糖核酸酶(RNASE1/RIB1/RNS1)免疫試劑盒 Human ribonuclease pancreatic,RNASE1/RIB1/RNS1
RatDihydrotestosterone,DHTELISAKit大鼠雙氫睪同(DHT)P
PCR實驗方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2：調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，在72℃ 保7min。
3：伴放線放線桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒結(jié)束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4：PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μl進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
定量PCR方法：
a、競爭法 產(chǎn)品僅用于科研實驗
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗di高辛酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品：
大鼠顆粒酶M(GZMM)ELISA試劑盒 ，英文名： GZMM ELISA Kit
Monkey endotoxin (ET) ELISA Kit內(nèi)毒素(ET)ELISA試劑盒
Ratmyeloperoxidase-aineuophilcytoplasmicaibodyIgG,MPO-ANCAIgGELISAkit 大鼠髓過氧化物酶特異性抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體IgG(MPO-ANCAIgG)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝
CLIAKitforFSHPoulyELISAKitFSH禽類酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒規(guī)格：48T/96T
細胞環(huán)氧化酶(CYCLOOXYGENASE)總活性比色法定量檢測試劑盒20次
RatplateletmembraneglycoproteinⅡbⅢa,GP-ⅡbⅢaELISAKit大鼠血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa(GP-ⅡbⅢa/CD41+CD61)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
小鼠0酸化表皮生長因子受體(pEGFR)ELISA試劑盒 ，英文名： pEGFR ELISA Kit
大鼠固酮(ALD)ELISA檢測試劑盒rataldosterone,ALDELISAKit 96T/48T
人抵抗素樣分子β(RELM-β)免疫試劑盒 Human RELM-β ELISA Kit
Ratneuophilgelatinase-associatedlipocalin,NGALELISAKit大鼠中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
ELISA制備試劑盒10次
Mousereducedglathione,GSHELISA試劑盒小鼠還原型(GSH)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
草魚出血熱病毒(GCHV)核酸檢測試劑盒Anti-Tat/FITC 熒光素標記細胞酪轉(zhuǎn)氨酶抗體IgGMulti-class antibodies規(guī)格： 0.2ml
IRS P53 (Insulin receptor substrate P53)(多肽) Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
臂板蛋白3A抗體 Anti-Sema3A 0.2ml
Snake poison Protein 英文名稱： 蛇毒蛋白抗體(中華眼鏡蛇) 0.2ml
ECH1 英文名稱： 烯酰水合酶1抗體 0.2ml
Rhesus antibody Rh phospho-MEF2C(Ser396) 0酸化肌細胞增強因子2C抗體 規(guī)格 0.1ml
IRS P53 (Insulin receptor substrate P53)(多肽) Multi-class antibodies規(guī)格： 0.5mg
化工儀器網(wǎng)