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上海谷研實(shí)業(yè)有限公司 |
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| 參考價(jià) | 面議 |
更新時(shí)間：2022-04-21 10:37:22瀏覽次數(shù)：262
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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 1ml|10×1ml |
|---|---|---|---|
| 貨號(hào) | GOY-01X9549 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 化工 |
| 主要用途 | 公司產(chǎn)品僅供科研 | 英文名稱 | Adenovirus expressing GFP-LC3B fusion protein |
公司產(chǎn)品僅用于科研細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。
二．細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
以下是細(xì)胞生物學(xué)試劑的詳細(xì)介紹：
中文名稱 | 英文名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 發(fā)貨周期 |
Adenovirus expressing GFP-LC3B fusion protein | 1ml|10×1ml | 1～3天 |
商品介紹：
本品是一種可以表達(dá)GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒，可以用于感染細(xì)胞或組織后進(jìn)行細(xì)胞自噬(autophagy)的檢測(cè)。 LC3是酵母自噬關(guān)鍵蛋白ATG8在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白。LC3初被分析鑒定為microtubule-associated protein 1 light chain 3 。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亞家族，其中對(duì)于LC3B的研究為廣泛。到目前為止，LC3B被認(rèn)為是細(xì)胞自噬信號(hào)通路為關(guān)鍵的標(biāo)志性蛋白。LC3B是一個(gè)具有125個(gè)氨基酸殘基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22個(gè)氨基酸蛋白，從而暴露出C端的甘氨酸，人們把它命名為胞質(zhì)形式的LC3B I。在細(xì)胞自噬的過程中，其C端暴露的甘氨酸經(jīng)過一個(gè)類似泛素化的過程，以ATG7為E1樣激活酶， 以ATG3為E2樣連接酶，以Atg12-Atg5-Atg16復(fù)合物為E3樣連接酶，在C端甘氨酸上共價(jià)連接上磷脂酰而成為L(zhǎng)C3B-PE即LC3B II。與胞質(zhì)定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬體的內(nèi)膜和外膜上。在自噬體與溶酶體融合后，自噬體外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬體內(nèi)膜上的LC3B II則被溶酶體內(nèi)的蛋白酶所降解。盡管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其強(qiáng)的疏水性，在SDS-PAGE電泳時(shí)，LC3B II比LC3B I遷移得更快，其表觀分子量分別為14kD和16kD。在用GFP-LC3B腺病毒感染細(xì)胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B以彌散的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以斑點(diǎn)的形式表現(xiàn)出來。 自噬是一種在進(jìn)化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關(guān)，在饑餓等不利的環(huán)境條件下， 細(xì)胞通過自噬降解多余或異常的細(xì)胞內(nèi)組分，為細(xì)胞的生存提供能量及原材料，促進(jìn)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化及對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生應(yīng)答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關(guān)系。由于細(xì)胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用，自噬已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。 Ad-GFP-LC3B是的重組腺病毒，感染后能夠在靶細(xì)胞中有效表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，可以用于細(xì)胞自噬的檢測(cè)。 腺病毒感染細(xì)胞后為瞬時(shí)表達(dá)，通常不會(huì)與基因組DNA重組，不能用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。本產(chǎn)品感染體內(nèi)外細(xì)胞后，有效表達(dá)時(shí)間通常不少于7天，不同細(xì)胞和組織的有效表達(dá)時(shí)間有所不同。感染10-14天后融合蛋白的表達(dá)很可能會(huì)大大減弱。 Ad-GFP-LC3B采用了成熟的E1缺陷型重組腺病毒載體系統(tǒng)，感染普通的細(xì)胞后不能進(jìn)行擴(kuò)增和重組，從而可以有效降低本產(chǎn)品在活體生物中的風(fēng)險(xiǎn)。 本產(chǎn)品可以在表達(dá)E1的HEK293A、HEK293等適當(dāng)細(xì)胞中擴(kuò)增。 本產(chǎn)品的滴度≥1×108 pfu/ml，使用時(shí)可以按照108pfu/ml進(jìn)行計(jì)算。如果按照20 MOI感染6孔板的細(xì)胞，每孔50萬細(xì)胞計(jì)算，共可以感染10個(gè)孔；如果按照20 MOI感染24孔板的細(xì)胞，每孔10萬細(xì)胞計(jì)算，共可以感染50個(gè)孔。如果MOI值提高，則相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會(huì)減少；如果MOI值降低，則相應(yīng)可以感染的孔數(shù)會(huì)增加。 儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期1～2個(gè)月。 |
操作步驟：
1. 樣品染色
1) 將Binding Buffer（10×）稀釋成1×Binding buffer工作液備用（1ml Binding Buffer（10×）需加入9ml無菌去離子水）。
2) 對(duì)于懸浮細(xì)胞，500-1000g離心5min收集細(xì)胞。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，要用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，胰酶消化時(shí)間不宜過長(zhǎng)或過短，最好是在輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，500-1000g離心5min收集細(xì)胞。
3) 收集細(xì)胞后，加入預(yù)冷PBS溶液輕搖或用移液器輕柔吹打洗滌，離心收集細(xì)胞，共洗滌兩次。
4) 在細(xì)胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×106 cell/ml。
5) 吸取100μl細(xì)胞懸液（細(xì)胞總數(shù)為1×105 cell）至一新管中，加入5μl Annexin V-FITC和5-10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。
2. 樣品檢測(cè)
1) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：
染色孵育后，每管加入400μl 1×Binding Buffer工作液，混勻后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)）。
建議設(shè)置經(jīng)凋亡誘導(dǎo)的正常細(xì)胞、PI單染和Annexin V-FITC單染3個(gè)對(duì)照組，正常細(xì)胞組可作為熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。結(jié)果可用CellQuest等軟件進(jìn)行分析，繪制雙色散點(diǎn)圖（two-color dot plot），F(xiàn)ITC為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)。Annexin V-FITC和PI聯(lián)合使用時(shí)，活細(xì)胞僅有很低強(qiáng)度的背景熒光，早期凋亡細(xì)胞僅有較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞有綠色和紅色雙重?zé)晒狻?/span>
2) 熒光顯微鏡檢測(cè)：
染色孵育后涂片，顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡上的藍(lán)光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被Annexin V-FITC結(jié)合的細(xì)胞顯示漿膜上有綠色光環(huán)。喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，細(xì)胞核顯示紅色，膜上有綠色光環(huán)。
凝血因子Ⅷ(FⅧ)英文名稱：FⅧ ELISA Kit銜接蛋白β抗體包裝1g
凝血因子Ⅶ(FⅦ)英文名稱：FⅦ ELISA Kit銜接蛋白γ/γ-Adaptin抗體包裝250mg
凝血因子Ⅵ(FⅥ)英文名稱：FⅥ ELISA Kit通道蛋白-9抗體包裝5g
凝血因子Ⅴ(FⅤ)英文名稱：FⅤ ELISA Kit膜粘連蛋白A3抗體包裝1g
凝血因子Ⅳ(FⅣ)英文名稱：FⅣ ELISA Kit膜粘連蛋白 A4抗體包裝50mg
凝血因子Ⅲ(FⅢ)英文名稱：FⅢ ELISA Kit自噬相關(guān)蛋白8A抗體包裝1g
凝血因子Ⅱ(FⅡ)英文名稱：FⅡ ELISA Kit磷化蛋白激B抗體包裝25g
凝血因子Ⅰ(FⅠ)英文名稱：FⅠ ELISA Kit磷化腺苷單磷活化蛋白激α1抗體包裝5g
凝血原片段F1+2(F1+2)英文名稱：F1+2 ELISA Kit磷化蛋白激B抗體包裝1g
凝血受體(TR)英文名稱：TR ELISA Kit脫氧胞苷脫蛋白抗體包裝250mg
凝血抗凝血復(fù)合物(TAT)英文名稱：TAT ELISA Kit蛋白激錨定蛋白13抗體包裝1g
凝溶膠蛋白(Gelsolin)英文名稱：Gelsolin ELISA KitAP-1μ2抗體包裝5g
尿微量白蛋白(ALB)英文名稱：ALB ELISA Kit肥大膜抑制性受體Allergin1抗體包裝5g
尿嘧啶核苷磷化1(UPP1)英文名稱：UPP1 ELISA Kit腦鈉通道蛋白1抗體包裝25MG
尿激型纖溶原激活物受體(PLAUR/uPAR)英文名稱：PLAUR/uPAR ELISA Kit肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合亞單位B1抗體包裝25g
α2巨球蛋白樣蛋白1抗體 α2ML1免疫球蛋白G(IgG)Nintedanib (BIBF 1120) is a potent triple angiokinase inhibitor for VEGFR1/2/3,
Ad-GFP-LC3B彎孢 中國(guó)肉桂皮油半乳糖凝集素9檢測(cè)試劑盒
枯草芽孢桿 黑莓提取物胞漿型磷脂酶A2檢測(cè)試劑盒
大腸埃希氏桿 秘魯浸膏胞外超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒
茯苓 杏子提取物飽腹因子檢測(cè)試劑盒
熒光假單胞 蘋果粉吡啶交聯(lián)物檢測(cè)試劑盒
美澳型核果褐腐病 甘草提取物（粉）表面活性蛋白A檢測(cè)試劑盒
放線纖維 KN-62表面活性蛋白D檢測(cè)試劑盒
藍(lán)色犁頭霉 磷脂酰甘油 PG表皮生長(zhǎng)因子檢測(cè)試劑盒
休哈塔假絲酵母 4-(三氟甲基)噠-3,5-二總表皮生長(zhǎng)因子受體檢測(cè)試劑盒
連香樹迪茲氏 2-氯-4-氨基-5-甲氧基嘧啶表皮生長(zhǎng)因子受體2檢測(cè)試劑盒
巨大芽孢桿 N,N-二甲基對(duì)甲苯氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒
食吡啶紅球 烯酸烯酯二檢測(cè)試劑盒
普通青霉 丁酸橙花酯酮檢測(cè)試劑盒
釀酒酵母 三正丁基膦酮酸激酶M2型同工酶檢測(cè)試劑盒
小牛葡萄球 1-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-3-甲基-1-丁酮酮酸脫氫酶激酶1檢測(cè)試劑盒
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