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          技術文章

          人正常組織來源細胞復蘇和傳代流程

          閱讀:598          發(fā)布時間:2018-5-17

          一、人正常組織來源細胞實驗前準備工作:
          1、培養(yǎng)瓶的包被:包被液如多聚賴氨酸(PLL,ScienCell品牌,貨號0403或0413)或纖維粘連蛋白(BPF,ScienCell品牌,貨號8248),以無菌水稀釋至2 ug/cm2的濃度包被培養(yǎng)瓶。37度孵箱1小時或4度過夜,從包被好的培養(yǎng)瓶中回收多聚賴氨酸,并用無菌水洗滌培養(yǎng)瓶2遍。包被好的培養(yǎng)瓶不要放置超過24小時,其中的包被液可吸出重復使用2-3次,注意不要污染。
           

          2、*培養(yǎng)基的配置:以內皮細胞培養(yǎng)基(ECM,ScienCell品牌,貨號1001)為例,把配套的胎牛血清(FBS,ScienCell品牌,貨號0025)、生長因子(ECGS,ScienCell品牌,貨號1052)和雙抗(P/S,ScienCell品牌,貨號0503)加入基礎培養(yǎng)液(ECM,ScienCell品牌,貨號1001)中。重新貼好標簽,并混勻培養(yǎng)基。

          二、原代細胞復蘇方法:
          1、從液氮中取出原代細胞冷凍管,迅速投入37~38 ℃水浴中,其間可以輕輕轉動細胞,加快融化速度,大約需要1分鐘時間。
          2、5分鐘內用培養(yǎng)基稀釋至原體積的10倍以上,加入培養(yǎng)瓶中,再用1ml培養(yǎng)基洗滌細胞凍存管,保證細胞都被加入培養(yǎng)瓶中,靜置于孵箱,12-16小時后更換培養(yǎng)基(除去DMSO)。以后每2天換一次液,保證細胞狀態(tài)良好。

          三、原代細胞傳代方法:酶消化法
          當細胞生長至70-80%左右可以傳代,傳代比例以1:2或1:3為佳。具體方法如下:
          1、棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基,用PBS洗滌培養(yǎng)瓶2遍,加入0.25%的胰酶消化液(Trypsin-EDTA,ScienCell品牌,貨號0103),以消化液能覆蓋整個瓶底為準。37度孵育4分鐘左右,輕拍培養(yǎng)瓶側面,顯微鏡下觀察細胞消化情況,直到80%細胞呈現(xiàn)圓形。
          2、細胞消化好后,加入胰酶中和液(TNS,ScienCell品牌,貨號0113),并輕輕搖動培養(yǎng)瓶,形成細胞懸液,然后將人正常組織來源細胞和培養(yǎng)基轉移至離心管中,1000rpm離心5分鐘。
          3、棄去上清液,以1-2ml新鮮培養(yǎng)基重新懸浮細胞并吹打均勻,接種于包被好的新培養(yǎng)瓶中,瓶中已有10ml左右的培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2天更換培養(yǎng)基。

           Cathepsin D 煙酰胺核苷酸轉氫酶抗體

           Cathepsin E 煙堿型乙酰膽堿受體α7抗體

           Cathepsin G 煙堿型乙酰膽堿受體α4抗體

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          人正常組織來源細胞

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