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解析轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)方法
閱讀：760 發(fā)布時(shí)間：2017-8-29轉(zhuǎn)化細(xì)胞比乳鼠心肌難養(yǎng)，用無血清培養(yǎng)基，呈桿狀，橫紋清楚，在培養(yǎng)基里細(xì)胞不搏動(dòng)。
大鼠心肌細(xì)胞分離一般是采用二型膠原酶分離，濃度為1mg/ml（用無鈣臺(tái)氏液配制），同時(shí)酶液里加入?；撬?，BSA。一般采用Langendorff灌流的方法，大鼠開胸后，迅速取出心臟，放入冰的臺(tái)氏液中，找到主動(dòng)脈后，掛上Langendorff裝置，衡流泵灌入無鈣臺(tái)氏液（37度），開始心臟會(huì)搏動(dòng)幾下，這樣把心臟中的淤血擠出（此處也有人用有鈣臺(tái)氏液灌流，好讓心臟充分搏動(dòng)，把淤血擠出，不過我們摸索發(fā)現(xiàn)只要取心臟到掛上去的時(shí)間短，一般搏動(dòng)幾下就能把淤血清楚干凈了）。幾分鐘后，換酶液開始灌流心臟，一般開始時(shí)，心臟較軟，待消化一段時(shí)間后變硬，繼續(xù)消化后又變軟，且心臟發(fā)白，這時(shí)候就可以停止消化，將心室剪下，放入KB液中，用剪刀剪碎后，用滴管吹打，取上清，繼續(xù)加入KB液，吹打，直到上清液不渾濁為止，一般吹打3－4次即可。將各次上清合并，吹打過濾后，沉降20分鐘左右，棄上清，加入無血清培養(yǎng)基（MEM，不含L－谷氨酰胺，并加入肌酸，?；撬幔珺SA，肉毒堿，HEPES），吹打，1000轉(zhuǎn)/分離心半分鐘，棄上清，再洗1－2次后，將沉淀加入到6％的BSA中沉降15－20分鐘（純化心肌細(xì)胞），然后計(jì)數(shù)，點(diǎn)板或培養(yǎng)。
此法中如果各步注意無菌操作，zui后先用加倍雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，再換正常培養(yǎng)基，可適用于條件不是很好的試驗(yàn)室。如果能在板或瓶?jī)?nèi)加入Laminin處理后，貼壁很好。如果分離出來的心肌細(xì)胞，逐級(jí)復(fù)鈣后培養(yǎng)，狀態(tài)更好。*狀態(tài)此中方法能培養(yǎng)7天以上。
膠原酶對(duì)膠原的消化作用強(qiáng)，它僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)細(xì)胞沒有影響，可使上皮細(xì)胞和膠原成分分離而不受損害，相反，胰酶作用時(shí)間長(zhǎng)會(huì)對(duì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用。因此我覺得你的細(xì)胞狀態(tài)不好可能不是膠原酶的原因。我也在養(yǎng)心肌細(xì)胞，消過程中也會(huì)有你說的蛋清一樣的狀態(tài)，但沒有是整個(gè)上清都是的情況，可能正如青山兄所說是你的胰酶放得太少了，5只老鼠可以放3ml的胰酶，我聽?zhēng)熜终f這種蛋清樣的東東含的細(xì)胞zui多，所以要?jiǎng)┝堪阉鰜?，另外我認(rèn)為吸的時(shí)候切勿把組織塊吸上來，我試過吸的組織塊過多，離心后組織快都還飄在懸液中，一倒就把牽有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的組織塊一塊到走了，到zui后所得的細(xì)胞就少很多。
先擠一會(huì)再剪，剪心室，大概就是心臟的下半部分。放入另一干凈的PBS溶液中，再洗洗。0.1％的胰酶每次消化大概10分鐘左右，吹打后，靜置1分鐘左右，然后吸取上清，加入胰酶繼續(xù)消化。
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轉(zhuǎn)化細(xì)胞