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人正常組織來源細(xì)胞染色體制備方法
閱讀:535 發(fā)布時間:2017-4-111、人正常組織來源細(xì)胞實驗材料
培養(yǎng)液(PRMI 1640、M199、DMEM等),小牛血清、0.025%胰蛋酶、秋水仙素,刻度離心管,直吸管及彎頭吸管,培養(yǎng)瓶或皿、KCL、甲醇、冰乙酸、載玻片。
2、培養(yǎng)液配制
培養(yǎng)液 85-95%
小牛血清 5-15%
雙抗(選擇) 100u/ml
3、人正常組織來源細(xì)胞操作過程
(1)培養(yǎng)細(xì)胞:選擇處于指數(shù)生長期、用大瓶培養(yǎng)的80-90%匯合單層培養(yǎng)細(xì)胞;
(2)終止培養(yǎng):當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時,加秋水仙素0.01-0.03ug/ml培養(yǎng)混合液,置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)6-10小時以抑制分裂期細(xì)胞停止于分裂中期;(3)聚集細(xì)胞:
(A) 搖動法:
可利用分裂中期細(xì)胞變圓與底物附著不牢特點,此時可持培養(yǎng)瓶,左右反復(fù)橫向水平搖動,可使90%的中期分裂細(xì)胞從瓶壁脫落;
(B) 消化法:
將培養(yǎng)液倒入離心管內(nèi),給培養(yǎng)瓶內(nèi)加0.025%胰蛋白酶液0.5-1ml/瓶,水平左右搖動,便培養(yǎng)瓶底壁面*接觸消化酶,稍后用彎頭吸管吹打,待細(xì)胞*脫落后,加入3-5ml前培養(yǎng)終止消化。用吸管移入裝有培養(yǎng)液的離心管內(nèi)2000rpm10分鐘。棄上清液,留沉淀細(xì)胞;
(4)低滲處理:給沉淀細(xì)胞加頂溫的37℃0.075MKCL8ml左右,用吸管打均勻,在溫箱中靜置20-30分鐘;
(5)預(yù)固定:向低滲處理適當(dāng)?shù)碾x心管中加新鮮配制的3∶2甲醇,冰乙醇固定液1-2ml,用吸管輕松吹打調(diào)勻,此措施能起到使細(xì)胞表面輕微固定,可防止固定后細(xì)胞粘連成塊。
(6)固定:800-1000rpm10分鐘,棄上清液加新鮮配制的3∶2甲醇冰乙酸固定液10ml,加入時要沿管壁慢慢加入,后輕輕吹打,封口后室溫靜置30分鐘以上,反復(fù)三次;
(7)制片:末次離心后,倒掉上清液,留沉淀細(xì)胞,人正常組織來源細(xì)胞加新鮮配制固定液0.5ml左右,混勻后冰片制片,其它同外周血方法。