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單個(gè)細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)分析
閱讀：1328 發(fā)布時(shí)間：2017-3-16材料
1．轉(zhuǎn)化細(xì)胞的制備經(jīng)過(guò)原代或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。
2．培養(yǎng)用液克隆適應(yīng)培養(yǎng)液、Hanks液、0.125％胰蛋白酶。
3．培養(yǎng)用品包括直徑為0.5mm，長(zhǎng)為8mm的毛細(xì)玻璃管，培養(yǎng)瓶皿、培養(yǎng)板（24孔、96孔）、吸管、微量加樣器等。
方法
1．稀釋克隆法
（1)毛細(xì)管克隆法
1)將一定量的細(xì)胞懸液（如105個(gè)／ml或更低）倍比稀釋至1個(gè)／ml;
2）取l0ml稀釋的細(xì)胞懸液，用直徑為0.5mm，長(zhǎng)為8mm的毛細(xì)玻璃管若干（30～50支），在負(fù)壓作用下，將懸液吸入各毛細(xì)管中；
3）在倒置顯微鏡下檢查出每管只有1個(gè)細(xì)胞的毛細(xì)管，然后放入適應(yīng)性培養(yǎng)基或有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶（皿）內(nèi)，置37℃ ,5% CO2孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞在毛細(xì)管內(nèi)繁殖后向管外擴(kuò)展時(shí)，會(huì)形成單細(xì)胞克隆的細(xì)胞群體。
(2）有限稀釋鋪板法：有限稀釋需將細(xì)胞懸液在一排試管中進(jìn)行梯變倍數(shù)稀釋，然后將稀釋的細(xì)胞懸液接種于微孔培養(yǎng)板（也可在96孔板上直接稀釋），使每孔僅含1個(gè)細(xì)胞。經(jīng)鏡下檢測(cè)，標(biāo)記下含單細(xì)胞的孔，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。數(shù)日后，凡在已標(biāo)記的孔中有生長(zhǎng)增殖的細(xì)胞集落即為克隆細(xì)胞。
1)低密度細(xì)胞懸液的制備：選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的狀況良好的待克隆細(xì)胞，如為貼壁細(xì)胞則先用胰蛋白酶消化，使其脫離瓶壁，經(jīng)反復(fù)吹打使細(xì)胞相互分離，用培養(yǎng)液梯變倍數(shù)稀釋細(xì)胞，分別稀釋成50/m1,10/m1,5/ml三種稀釋度的細(xì)胞懸液。
2)接種：先用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，使之混懸均勻。將三種稀釋度的細(xì)胞分別用加樣器接種于96孔培養(yǎng)板，每孔分別加100ul細(xì)胞懸液（100ul內(nèi)平均細(xì)胞分別為5,1,0.5個(gè)細(xì)胞）和100ul培養(yǎng)液。接種時(shí)要迅速準(zhǔn)確，爭(zhēng)取在zui短時(shí)間內(nèi)加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)。迅速蓋好蓋板，置于37℃,5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3）標(biāo)記與培養(yǎng)：培養(yǎng)6～12小時(shí)待細(xì)胞下沉并貼附于培養(yǎng)板孔底后，從溫箱中取出培養(yǎng)板，置于倒置顯微鏡臺(tái)上，觀察和標(biāo)記下含單個(gè)細(xì)胞的孔。以單個(gè)細(xì)胞落于孔底平坦部而周邊清晰者為符合要求。然后，送回C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間視其pH的變化決定是否換液或補(bǔ)加培養(yǎng)液。
4）分離擴(kuò)大培養(yǎng)：將接種細(xì)胞培養(yǎng)72～96小時(shí)后進(jìn)行觀察。挑選生長(zhǎng)良好的單細(xì)胞克隆孔。先吸去舊培養(yǎng)液，用Hanks液洗1～2次。然后加胰蛋白酶溶液少許進(jìn)行消化。置于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓時(shí)，加入0.1 ml含10％胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。用吸管輕輕吹打，當(dāng)細(xì)胞脫壁懸浮后，一并吸入24孔板或另一培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加一定量培養(yǎng)液，置C02培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)。待形成新的細(xì)胞群體后，即轉(zhuǎn)用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。
2．飼養(yǎng)層克隆法分離的單個(gè)細(xì)胞和密度極低的分散細(xì)胞很難存活和增殖，為了促使剛剛克隆化的極少量細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，常采用“飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cell)”促進(jìn)克隆細(xì)胞的增殖。常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有成纖維細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。
(1)飼養(yǎng)層的制備：取人或動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞，待轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)至旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用60Coγ射線以40～60Gy單次照射細(xì)胞，其目的是使細(xì)胞喪失有絲分裂能力，但仍可短期存活，有代謝功能，不僅可維持pH值而且還可為克隆細(xì)胞提供必要的養(yǎng)分及其刺激生長(zhǎng)因子。將飼養(yǎng)層細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24～48小時(shí)，便可直接作飼養(yǎng)細(xì)胞之用。
(2）接種細(xì)胞：先將經(jīng)60Coγ射線照射過(guò)的飼養(yǎng)細(xì)胞準(zhǔn)備好待用；然后取生長(zhǎng)至指數(shù)增生期的用作克隆的細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后制備成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)并將其稀釋成20～200/ml;棄掉飼養(yǎng)細(xì)胞瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，注入稀釋的待克隆細(xì)胞懸液。做飼細(xì)胞層克隆細(xì)胞時(shí)，還應(yīng)設(shè)對(duì)照組，對(duì)照組中只接種待克隆細(xì)胞懸液，沒(méi)有飼細(xì)胞層。
(3）克隆形成：將待克隆的細(xì)胞懸液接種到飼養(yǎng)細(xì)胞層后，培養(yǎng)2～3周，每周換液一次，待克隆出現(xiàn)后，或分離，或計(jì)算克隆形成率。
3．膠原膜板或血纖維蛋白膜層板克隆法原代培養(yǎng)細(xì)胞容易黏附于膠原膜層或血纖維蛋白膜層等生長(zhǎng)基質(zhì)成分之上。在細(xì)胞克隆中，用膠原膜層或血纖維蛋白膜層代替飼養(yǎng)細(xì)胞，可幫助單個(gè)細(xì)胞和密度極低的分散細(xì)胞都附著貼壁、存活并逐漸繁殖。以血纖維蛋白膜層板為例介紹細(xì)胞克隆技術(shù)。
(1)血纖維蛋白膜層的制備
1)取0.2ug凝血酶溶于l00ml克隆培養(yǎng)液中，制成A液；另取250mg牛血纖維蛋白原，800mg NaCl和25 mg枸櫞酸鈉，共溶于l000ml重蒸水中，制成B液。
2)取B液1ml和A液4ml，放入培養(yǎng)皿內(nèi)盡快混合，幾分鐘后即形成透明膠層。
(2）消化、接種和培養(yǎng)待克隆細(xì)胞
1)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)細(xì)胞，用胰蛋白酶溶液消化后制備細(xì)胞懸液。
2)用培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，一般以每一培養(yǎng)器皿內(nèi)生長(zhǎng)1～10個(gè)克隆的細(xì)胞濃度為zui適。例如，克隆效應(yīng)為5％～10％時(shí)，則一個(gè)器皿內(nèi)接種100個(gè)細(xì)胞為宜。
3）將細(xì)胞懸液按所需數(shù)目種入鋪有生物基質(zhì)層的培養(yǎng)器皿內(nèi)，于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換培養(yǎng)液1次。
(3)觀察并計(jì)數(shù)克隆之?dāng)?shù)目：幾周后可見(jiàn)有由500～1000個(gè)細(xì)胞形成的群落。
4．軟瓊脂克隆分離法瓊脂層是一種簡(jiǎn)單的生長(zhǎng)基質(zhì)層，可幫助細(xì)胞貼附生長(zhǎng)。但瓊脂中含有酸性硫酸多糖，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞有一定的抑制作用。對(duì)于正常貼壁細(xì)胞在軟瓊脂中不能形成克隆，本法僅適于懸浮培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞或惡性程度高的貼壁細(xì)胞。目前多用半固體培養(yǎng)基克隆方法。
(1)制備細(xì)胞懸液：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液（貼壁細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，使之分散成單個(gè)細(xì)胞），做活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至（1～5)×104個(gè)細(xì)胞／L。
(2）制備底層瓊脂：取5％瓊脂置沸水浴中使瓊脂*溶化，取出1份5％瓊脂移入小燒杯中，待冷卻至50℃，迅速加入9份預(yù)溫37℃的新鮮培養(yǎng)液（即成為0.5％瓊脂），均勻后立即澆入24孔培養(yǎng)板中，每孔含0.5％瓊脂培養(yǎng)基0. 8ml，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。
(3)制備上層瓊脂：取37℃保溫的不同密度的細(xì)胞懸液9.4ml移入小燒杯中，加入50℃的5%瓊脂0.6ml，迅速混勻，即配成0.3％瓊脂培養(yǎng)基，立即澆入鋪有（或無(wú)）底層瓊脂的24孔培養(yǎng)板中，每孔加0.8 ml，置室溫使瓊脂凝固。每孔細(xì)胞數(shù)量可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩?lái)確定。一般可調(diào)整每孔含25,50和100個(gè)細(xì)胞的梯度密度。
(4)培養(yǎng)與觀察：培養(yǎng)板于37℃ ,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2周或更長(zhǎng)，若需培養(yǎng)更長(zhǎng)時(shí)間，每孔可補(bǔ)加0.8ml含瓊脂的培養(yǎng)液，注意觀察培養(yǎng)液的顏色變化和有無(wú)明顯集落形成，培養(yǎng)液變酸要及時(shí)換液，集落形成要計(jì)數(shù)克隆數(shù)或取克隆細(xì)胞擴(kuò)大增殖。
【結(jié)果及注意事項(xiàng)】
1．觀察結(jié)果并集落（克?。┯?jì)數(shù)在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)直徑大于75 um或含有50個(gè)細(xì)胞以上的集落。經(jīng)培養(yǎng)后能夠增殖形成克隆的百分率稱集落（克隆）形成率( cloning efficiency)，以下述公式計(jì)算。
2．克隆形成率與接種細(xì)胞的密度有一定的相關(guān)性。細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度越大，接種時(shí)每平方厘米培養(yǎng)皿上接種的細(xì)胞越多，克隆的形成率就越低。為提高克隆形成率，須將細(xì)胞懸液稀釋成密度為10/ml，甚至更低，接種的密度也要小。見(jiàn)表3-2。
3．細(xì)胞克隆形成率低于10％應(yīng)采取增強(qiáng)細(xì)胞同化能力的措施。如①選定克隆形成效率比較高的培養(yǎng)液作為zui適的克隆化培養(yǎng)液；②用胎牛血清作培養(yǎng)液中的血清成分，比小牛血清*；③調(diào)控C02濃度，C02可提高絕大多數(shù)細(xì)胞克隆形成率，常用5％濃度。對(duì)有的細(xì)胞，如人成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞克隆時(shí)，2％的C02效果可能更好。HEPES (20mmol/L )與2％的C02配合使用能很好緩沖培養(yǎng)液pH值的波動(dòng)，使細(xì)胞盡量少受這一因素的影響。
適應(yīng)培養(yǎng)基中加入添加細(xì)胞刺激因子，某些激素（如胰島素、地塞米松等）和生長(zhǎng)因子有促進(jìn)細(xì)胞克隆形成的作用。含1～lOIU/ml胰島素的培養(yǎng)液對(duì)許多種細(xì)胞的克隆形成均有促進(jìn)作用。地塞米松也能提高人正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等的克隆形成率。而表皮生長(zhǎng)因子可促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等生長(zhǎng)，推薦使用濃度為1～20ng/ml。
4．飼養(yǎng)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，單個(gè)細(xì)胞和密度極低的分散細(xì)胞很難存活和逐漸繁殖。飼養(yǎng)細(xì)胞為克隆細(xì)胞創(chuàng)造了適宜生長(zhǎng)的微環(huán)境。飼養(yǎng)細(xì)胞也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過(guò)射線照射處理的、供其他細(xì)胞附著的細(xì)胞層。飼養(yǎng)細(xì)胞受射線照射后，失去其分裂能力，但仍存活并有同化營(yíng)養(yǎng)液的能力，待克隆的細(xì)胞散落在飼養(yǎng)細(xì)胞上層并與之接觸。細(xì)胞克隆形成后，飼養(yǎng)細(xì)胞逐漸死亡，換液時(shí)可被清除。
5．增強(qiáng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的貼壁能力以促進(jìn)細(xì)胞克隆形成一種簡(jiǎn)單的生長(zhǎng)基質(zhì)層是瓊脂層，常用濃度為2%。瓊脂層制備后，可把細(xì)胞接種在瓊脂層上。惡變細(xì)胞或惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞在軟瓊脂(1.2%）中的生長(zhǎng)，與在裸鼠體內(nèi)的致瘤性有很大一致性。因此測(cè)試細(xì)胞能否在軟瓊脂中生長(zhǎng)，已成為測(cè)試轉(zhuǎn)化細(xì)胞惡性的重要指標(biāo)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞易貼附于膠原層或血漿纖維蛋白層生長(zhǎng)基質(zhì)上。用多聚右旋賴氨酸（poyrylysine）包被培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿底壁，能提高用低血清培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞克隆形成率。其包被方法是：①配制濃度為1mg/ml的多聚右旋賴氨酸水溶液，用以濕潤(rùn)培養(yǎng)瓶底；②倒出多聚賴氨酸溶液，用5m1 PBS沖洗培養(yǎng)瓶皿1次后，即可立即使用。用培養(yǎng)液配制的濃度為5 ug/ml的纖維粘連蛋白（fibronectin )處理培養(yǎng)瓶后亦有類似效應(yīng)。