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詳細(xì)介紹
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明：
1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法；
2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理；
3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕；
4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率；
5．如果細(xì)胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。
產(chǎn)品屬性：
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號(hào) |
| 小鼠表皮角化上皮細(xì)胞 | 5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶 | GOY-01X1315 |
商品介紹：
名稱 小鼠表皮角化上皮細(xì)胞 2.組織來源：皮膚組織 3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶 4.細(xì)胞簡介： 小鼠表皮角化細(xì)胞分離自皮膚組織；表皮位于動(dòng)物皮膚的外層，由胚胎時(shí)期外胚層形成，具有抗摩擦和抗損傷的作用。表皮是皮膚的淺層結(jié)構(gòu)，由復(fù)層扁平上皮構(gòu)成。從基底層到表面可分為五層，即基底層、棘層、顆粒層、透明層和角質(zhì)層。表皮角化細(xì)胞（KC）是構(gòu)成表皮的主要細(xì)胞成分，在體內(nèi)處于不斷增殖過程中，分裂的角化細(xì)胞主要位于其基底層，少數(shù)位于棘細(xì)胞層。隨著向表層的推移，細(xì)胞的分化程度逐漸增加，并喪失分裂活性。 5.方法簡介： 實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠表皮角化上皮細(xì)胞先中性蛋白酶消化、后胰蛋白酶-膠原酶混合消化法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。 6.質(zhì)量檢測(cè)： 實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠表皮角化上皮細(xì)胞經(jīng)PCK免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。 7.培養(yǎng)信息： 包被條件鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） 培養(yǎng)基含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等 產(chǎn)品貨號(hào)CM-M215 換液頻率每2-3天換液一次 生長特性貼壁 細(xì)胞形態(tài)上皮細(xì)胞樣 傳代特性可傳1-2代左右 消化液0.25%胰蛋白酶 培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%；CO2，5% |
冷凍保存細(xì)胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過1 小時(shí)， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
實(shí)驗(yàn)報(bào)告：
一、分離與培養(yǎng)：
1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將成1mm3左右大??；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；
4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；
二、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；
2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；
4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；
5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；
6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。
小鼠 E-Selectin / CD62e / SELE 細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) (變性)
小鼠 IFNA14 / Interferon alpha-14 細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) (變性)
小鼠 CES3 / Carboxylesterase-3 / CES1D 細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) (變性)
RAB27B 細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) (變性)
GPHA2 / Glycoprotein hormone alpha 2 細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) (變性)
KCT2 / C5orf15 細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) (變性)
GALNT2 / GalNAc-T2 細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) (變性)
COL5A2 細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) (變性)
PNLIPRP1 / PLRP1 細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) (變性)
SMR3B 細(xì)胞裂解液 (陽性對(duì)照) (變性)
小鼠表皮角化上皮細(xì)胞1-丁基-3-甲基咪唑六氟鹽 97%肼黃 85%Anti-Phospho-5-Lipoxygenase (Ser271) /FITC 熒光素標(biāo)記化5-脂氧合抗體IgG
1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽 97%柯衣定 ARAnti-Phospho-5-Lipoxygenase (Ser663) /FITC 熒光素標(biāo)記化5-脂氧合抗體IgG
1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸鹽 97%香紫蘇內(nèi)酯 97%Anti-5-HTT/SERT/FITC 熒光素標(biāo)記5-羥色轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗體IgG
1-丁基-4-甲基吡六氟鹽 99%S-聯(lián)萘酚 99%Anti-8-OHdG/FITC 熒光素標(biāo)記兔抗8-羥基脫氧鳥苷蛋白抗體IgG
冠6烯 98%雙(二苯基膦) 98%Anti-AACT-Alpha1 /RBITC 紅色熒光素羅丹明標(biāo)記α-1抗胰糜蛋白IgG
冠-8-烯 90%1,2-雙(二苯基膦)乙烷 98%Anti-AACT-Alpha1/FITC 熒光素標(biāo)記α-1抗胰糜蛋白
環(huán)己硫 98%1,1'-雙(二-叔丁基膦基)二茂鐵 98%Anti-AAK1/FITC 熒光素標(biāo)記AP2關(guān)聯(lián)激1抗體IgG
4-氯吡-2-甲酸甲酯 98%1,5-雙(二苯基膦)戊烷 97%Anti-AARS2/FITC 熒光素標(biāo)記氨酰tRNA合成2抗體IgG
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