收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過(guò)夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細(xì)胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

產(chǎn)品名稱

名稱    CIK細(xì)胞

由于該細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，故又稱為NK細(xì)胞（自然殺傷細(xì)胞）樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性，和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。該細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力很強(qiáng)，能精確“點(diǎn)射"腫瘤細(xì)胞，但不會(huì)傷及“無(wú)辜"的正常細(xì)胞。尤其對(duì)手術(shù)后或放化后患者，能消除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶，防止癌細(xì)胞擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，提高機(jī)體免疫力，因此，CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代的腫瘤過(guò)繼細(xì)胞免疫方案。

CIK細(xì)胞可以通過(guò)多機(jī)制抗腫瘤、抗病毒：

1.CIK細(xì)胞能以不同的機(jī)制識(shí)別腫瘤細(xì)胞，通過(guò)直接的細(xì)胞質(zhì)顆粒穿透封閉的腫瘤細(xì)胞膜進(jìn)行胞吐，釋放穿孔素、顆粒酶，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的裂解；

2.CIK細(xì)胞能分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6等多種炎性細(xì)胞因子，對(duì)腫瘤也有直接抑制作用；

3.CIK細(xì)胞可以通過(guò)配體-受體（Fas:FasL）介導(dǎo)的方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此CIK尤其適用于FasL陽(yáng)性腫瘤的；

4.CIK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能顯著刺激初始型T細(xì)胞增殖，有效激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使之趨于正常，提高病人自身抗腫瘤的能力。

目前，腫瘤的發(fā)生機(jī)制尚未形成普遍接受的理論。研究者普遍認(rèn)可腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與人體的免疫功能密切相關(guān)。即在正常情況下，腫瘤與機(jī)體的防御機(jī)能之間處于一種動(dòng)態(tài)的平衡，而一旦這種平衡被破壞，就可能發(fā)生腫瘤。身體各組織細(xì)胞受到外界化學(xué)、物理、生物等因素刺激或自身細(xì)胞衰老變異等因素的影響，使得體內(nèi)某些細(xì)胞發(fā)生突變，成為癌前細(xì)胞；而機(jī)體免疫功能低下或者由于免疫異常，無(wú)法及時(shí)識(shí)別、殺傷、清除這些異常細(xì)胞，突變細(xì)胞在組織內(nèi)復(fù)制生長(zhǎng)，達(dá)到一定數(shù)量后破壞器官功能，腫瘤即發(fā)生。腫瘤患者，尤其是惡性腫瘤病人往往免疫功能、特別是細(xì)胞免疫功能低下，因而疾病呈進(jìn)展、活動(dòng)、預(yù)后差。因此，提高機(jī)體免疫力，建立有效的免疫應(yīng)答是腫瘤最有希望的途徑。CIK細(xì)胞即將大量殺傷性高、功能強(qiáng)、數(shù)量多的免疫活性細(xì)胞回輸患者體內(nèi)，直接發(fā)揮殺死腫瘤細(xì)胞的作用，并通過(guò)調(diào)節(jié)、激活患者的免疫體系，調(diào)動(dòng)、提高患者自身的抗腫瘤能力。

CIK細(xì)胞具有以下突出的特點(diǎn)：

1.增殖速度快，殺瘤活性高。CIK細(xì)胞可以在體外大量擴(kuò)增，培養(yǎng)14天可以增殖200倍以上，其效應(yīng)細(xì)胞CD3+CD56+的增殖可達(dá)1000倍以上，抗腫瘤活性得以大大增強(qiáng)。

2.殺瘤譜廣。CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷是非MHC限制的，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有殺滅作用。

3.能抵抗腫瘤細(xì)胞引發(fā)的效應(yīng)細(xì)胞Fas-FasL凋亡。CIK細(xì)胞雖然在Fas被占據(jù)后會(huì)引起少量細(xì)胞凋亡，但對(duì)其殺瘤細(xì)胞毒性沒(méi)有明顯影響；反之，CIK細(xì)胞可以誘導(dǎo)FasL陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的凋亡。

4.對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感。CIK細(xì)胞對(duì)放、化敏感的親本細(xì)胞和不敏感的轉(zhuǎn)化細(xì)胞均具有強(qiáng)大的殺傷活性。

5.CIK細(xì)胞殺瘤活性不受CsA（環(huán)孢霉素A）和FK506（普樂(lè)可復(fù)）等免疫抑制劑的影響。

6.對(duì)正常骨髓造血前體細(xì)胞毒性小，僅對(duì)紅系生成產(chǎn)生輕微的抑制，這可能與CIK細(xì)胞自身分泌高水平的IFN-γ有關(guān)。

7.CIK細(xì)胞具有識(shí)別腫瘤的機(jī)制，特異性強(qiáng)，對(duì)正常的細(xì)胞無(wú)毒性作用。

8.安全性好。CIK細(xì)胞是活化的患者自體細(xì)胞，應(yīng)用安全，不會(huì)產(chǎn)生排斥等反應(yīng)，患者副反應(yīng)小。

產(chǎn)品特點(diǎn):

1、 使用方便:不需昂貴設(shè)備。

2、 可以處理各種細(xì)菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時(shí)間縮短至30分鐘-1小時(shí)。

4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

6、 紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。

8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一、凍存時(shí)的注意事項(xiàng)：

1. 在冷凍保存之前，應(yīng)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細(xì)胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細(xì)胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。

4. 冷凍保存的細(xì)胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細(xì)胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細(xì)胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些雜交瘤會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后。

4-3.貼壁腫瘤細(xì)胞: 1 x 10^6，依細(xì)胞種類而異。腺癌類的細(xì)胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細(xì)胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細(xì)胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。