簡介

對于監(jiān)測細胞數(shù)目、繁殖、健康、融合度和細胞毒性的多種生物學(xué)應(yīng)用，需要進行無標記細胞檢測。這些應(yīng)用需要使用有效和可靠的透射光(TL)成像和分析功能，此功能可提供精確分割以定量細胞并評估各種細胞反應(yīng)和形態(tài)。此外，高對比度透射光成像與熒光標記成像的結(jié)合對于許多基于細胞的檢測分析來說是非常重要的。

MetaXpress 6.5自定義模塊編輯器中的TL 細胞分割算法是一種使用透射光對細胞進行成像及定量的優(yōu)化且可靠的分析算法。此應(yīng)用說明展示了TL細胞分割的實用性和準確性。通過將透射光中的總細胞計數(shù)與熒光染色的細胞核計數(shù)進行比較來分析和定量 CHO和HeLa細胞的算法（圖 1）。

方法

將CHO和HeLa細胞稀釋液接種到黑色、底部透明的96孔板中，從板頂行開始布板（最頂行中每孔20，000個細胞）。將每種細胞按1：2的比例在微孔板中向下進行稀釋，6個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)24小時后，在 37°C、5% CO2 的培養(yǎng)箱中用Hoechst 33342細胞核染料對細胞染色30分鐘。然后用4%多聚甲醛固定細胞，并用DPBS洗滌兩次。通過ImageXpress® Micro高內(nèi)涵成像系統(tǒng)和MetaXpress軟件對細胞進行成像。使用10x Plan Fluor物鏡對一個視野進行成像，該物鏡可準確捕獲多達1500個細胞。使用透射光和DAPI熒光通道拍攝圖像，曝光時間分別為15 ms和35 ms。

優(yōu)勢

使用
透射光成像對目標物進行分割和計數(shù)監(jiān)測透射光下的細胞增殖

使用多種分析方法評估TL細胞分割算法的效果

了解多種細胞類型和大小的量化工具
定量和分析工具

圖 1：設(shè)置用于分析透射光下拍攝的HeLa和CHO細胞圖像的自定義模塊。 使用Hoechst 33342細胞核染料對細胞進行染色。使用DAPI通道和透射光 (TL) 進行細胞成像，設(shè)置自定義模塊以根據(jù)透射光成像和細胞核熒光成像分析和定量細胞。

在自定義模塊編輯器中設(shè)置TL細胞分割算法

精準的細胞分割對于定量通過透射光捕獲的細胞而言非常重要。為TL細胞分割選擇的細胞算法A可以精確地分割和識別HeLa和CHO細胞 （圖 2）。還有其他設(shè)置可供選擇。細胞算法B或細胞算法C可分別用于分析小細胞或大細胞。在分析模塊中進行設(shè)置可以過濾總面積小于150 pM2的細胞（圖 3）。這個設(shè)置可以確保避免將圍攏的小型死細胞當(dāng)做活細胞進行計數(shù)和分析。此外，經(jīng)過設(shè)置的細胞核計數(shù)算法可以準確定量HeLa和CHO的細胞核（圖 4）。

結(jié)合透射光下的細胞計數(shù)與熒光胞核計數(shù)

使用TL細胞分割算法設(shè)置的自定義模塊可精確分割HeLa和CHO 細胞（圖 6）。透射光中的總細胞計數(shù)和細胞核計數(shù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異，表明TL細胞分割算法的準確性（圖 7）。除細胞計數(shù)外，TL細胞分割算法還可生成多個數(shù)據(jù)以評估細胞反應(yīng)和細胞形態(tài)的不同特征（圖 5）。例如，可生成細胞和細胞內(nèi)目標物的總計數(shù)和平均計數(shù)、面積、強度、形狀、高度、寬度以及各種其他不同的讀數(shù)。使用過濾器選項去除圍攏的死細胞可進一步優(yōu)化此過程，并減少使用活細胞或全細胞染色的必要性。此外，細胞核染色和計數(shù)細胞核對象算法的使用展現(xiàn)了可通過分析透射光成像。

圖 2. 將TL細胞分割算法應(yīng)用于選定的HeLa細胞透射光圖像。在自定義模塊編輯器中，可以通過設(shè)置選擇源波長和代表細胞類型對TL細胞分割算法進行配置。細胞算法A可以有效地識別圖像中的HeLa和CHO細胞。

圖 3. TL細胞分割疊加和過濾器設(shè)置篩選后疊加的比較圖像。 將最小面積設(shè)置為150 μm2以過濾掉死細胞。

圖 4. 使用細胞核對象分割模塊對熒光細胞核圖像進行計數(shù)。根據(jù)細胞核對細胞進行定量，使用Hoechst 33342對細胞核進行染色。對超過局部背景參數(shù)的最小和最大寬度估值和強度進行優(yōu)化，以精準識別所有細胞核。細胞核為藍色（左圖），分析遮蔽為黃色（右圖）。

圖 5. HeLa細胞的代表性圖像，設(shè)置自定義模塊圖像分析方法。 藍色遮蔽代表通過TL細胞分割算法使用TL過濾器遮蔽篩選發(fā)現(xiàn)的細胞，黃色代表通過計數(shù)核對象算法發(fā)現(xiàn)的細胞核。自定義模塊的所需測定項可在測定選項卡中進行設(shè)置。需要測定的對象被定義為可以通過TL細胞分割算法進行遮蔽的對象，選擇計數(shù)核對象遮蔽測定每個目標物的特性。

圖 6. HeLa和CHO細胞的圖像，以及應(yīng)用TL細胞分割自定義模塊優(yōu)化后的圖像分析結(jié)果。DAPI 細胞核以藍色顯示（左），在圖像分析中掩膜為黃色（右），透射光中的細胞以淺藍色掩膜。通過10x Plan Fluor物鏡在ImageXpress Micro系統(tǒng)上捕獲圖像，并使用新TL細胞分割算法配置的自定義模塊對圖像進行分析。

圖 7. 基于TL細胞分割和核計數(shù)對象模塊比較HeLa和CHO細胞的總細胞計數(shù)。 按1：2的比例稀釋細胞，從每孔20，000個細胞的濃度開始。

結(jié)論

MetaXpress自定義模塊編輯器中的TL細胞分割算法可以有效定量和分析多種細胞類型和大小。ImageXpress® Micro Confocal轉(zhuǎn)盤共聚焦高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)支持的優(yōu)化分割功能可分析與熒光團無關(guān)的細胞形態(tài)學(xué)。使用透射光圖像定量細胞可以使研究人員的檢測能力更加靈活。此應(yīng)用說明描述的方法展現(xiàn)了TL細胞分割算法可用于多種檢測，包括但不限于增殖、細胞毒性研究和轉(zhuǎn)染。