蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒實(shí)驗流程：
1.需要用戶自己準(zhǔn)備的試劑
a.固定液：4%多聚甲醛/通用型組織固定液(abs9179；
b.分化液：5%的乙酸溶液或0.5%的鹽酸乙醇；
c.如果需要脫水、透明和封片處理，還需自備二甲苯，和封片劑(如中性樹膠(鏡檢用封片劑)abs9177），及80%乙醇、90%乙醇、無水乙醇；
d.70%乙醇。
2.樣品處理
a.對于石蠟切片：
二甲苯中脫蠟5-10分鐘；
換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘；
無水乙醇5分鐘；
90%乙醇2分鐘；
80%乙醇2分鐘；
70%乙醇2分鐘；
蒸餾水2分鐘。
b.對于冰凍切片：
固定液固定10分鐘以上；
蒸餾水2分鐘。
c.對于培養(yǎng)細(xì)胞：
固定液固定10分鐘以上；
蒸餾水洗滌2分鐘；
換用新鮮的蒸餾水，再洗滌2分鐘。
3.蘇木素：水化后，組織切片用蘇木素染色 1~3min，可根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整染色時間。 蘇木素是一種基本染料，可以對細(xì)胞的酸性成分進(jìn)行染色，包括核酸、粘多糖、酸性糖蛋白， 將他們?nèi)境伤{(lán)-紫色。 注意：沒有蘇木素，伊紅會將組織染成亮粉紅色；顯而易見的是缺乏細(xì)胞核。組織結(jié)構(gòu)很難 區(qū)分，細(xì)胞內(nèi)成分幾乎都不存在，難以辨別。
4.水洗：蘇木素染色后，用水洗組織是非常重要的。這一步以及隨后的水洗，可將多余的 染料，媒染劑等去除。適當(dāng)?shù)钠纯梢匀コ砻娼饘俟鉂?，金屬光澤可阻止蘇木素的染色。 注意：跳過此步，將產(chǎn)生不好的結(jié)果，例如沉淀的形成，染液的稀釋，表面金屬光澤的存在。
5.酸酒精：酸酒精分色劑 3~5sec。在蘇木素染色方法中，組織切片有意過度染色，酸酒精 將去除多余的染料以及玻片上的背景染色。 注意：如果沒有此步驟，組織切片將變?yōu)榘底仙Ｊ人峤Y(jié)構(gòu)，例如，膠原，將不會呈現(xiàn)明亮 的粉紅色。組織結(jié)構(gòu)之間將很難區(qū)分。很難對切片做出正確的判斷。 分色過度可能是由于： 1)酸濃度過高； 2)脫色時間過長等。 分色不足是由于： 1)酸濃度過低； 2)脫色時間不足； 3)在切片上有多余的蛋白或者明膠等。
6.水洗：水洗 30sec，終止酸酒精反應(yīng)，進(jìn)一步阻止酸酒精從組織切片上將大量蘇木素去除。 注意：如果切片沒有經(jīng)過漂洗，酸酒精可以過度脫色。如果不去除脫色劑，酸酒精將持續(xù)從 組織切片上去除蘇木素。
7.自來水沖洗或用藍(lán)化液藍(lán)化：自來水沖洗 3~5min，可起到發(fā)藍(lán)處理，將紫紅色的蘇木素 轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色。通常，發(fā)藍(lán)試劑是 pH 依賴性的，由堿性溶液構(gòu)成。因此，如果自來水作為 發(fā)藍(lán)試劑，pH 值的每天監(jiān)控是非常重要的，因為自來水的 pH 值可能每天都會波動。 或用藍(lán)化液藍(lán)化，30sec~1min；流動的自來水沖洗 5min； 注意：跳過發(fā)藍(lán)試劑步驟，將會導(dǎo)致蘇木素染液的顏色發(fā)生微妙的變化，難以區(qū)分。代替深 藍(lán)色，細(xì)胞核將呈現(xiàn)紫色，有時甚至是紅色。細(xì)胞核不可過度藍(lán)染。如果組織染色過藍(lán)，一 般是在組織切片上蘇木素過多所致。
8.水洗：為伊紅復(fù)染做準(zhǔn)備，通過水洗 30sec，將多余的發(fā)藍(lán)試劑去除。因為在堿性環(huán)境下， 伊紅無法染色，水洗去除發(fā)藍(lán)試劑將允許伊紅保持其酸性 pH 值，使伊紅得以均勻復(fù)染。 注意：發(fā)藍(lán)試劑之后，如果沒有水洗，組織切片無法正確使用伊紅染色。因此，酸性結(jié)構(gòu)將 被染為蒼白色并且不均勻，進(jìn)而導(dǎo)致錯誤的判斷。
9.伊紅：為了正確區(qū)分胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，伊紅是出色的蘇木素復(fù)染劑。伊紅復(fù)染 30~60sec，可根 據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整染色時間。伊紅是酸性染料，可染細(xì)胞質(zhì)，尤其是線粒體、分泌顆粒 和膠原。它可以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器以及不同的結(jié)締組織。 注意：使用伊紅復(fù)染組織切片的失敗，將導(dǎo)致組織切片的低分化。 染色較弱是由于： 1）組織切片過?。?2）染色時間不足； 3）隨后 95%酒精分化過度。 染色過度是由于： 1）染液濃度較高（可能是由于過度蒸發(fā)）； 2）組織切片過厚； 3）染色時 間過長； 4）隨后 95%酒精分化不足。 伊紅染色未分化（一種顏色）是由于： 1）固定不*； 2）過度染色，a）染色時間過長；b）染液濃度過高。
10.95%乙醇：95%乙醇處理 2 s~1 min，根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整；伊紅分化將產(chǎn)生不同的 粉色。 注意：如果 95%乙醇被稀釋（例如，從前一步染色中攜帶了伊紅），分化的效果較差。
11.100%乙醇：通過 100%乙醇使組織切片脫色。100%乙醇處理 1 min；再用新的 100%乙醇 處理 1 min。 注意：這一步很難引起注意，若無 95%乙醇，難以區(qū)分酸性結(jié)構(gòu)，組織切片成為粉色。若 無 100%乙醇脫水，組織切片不能*脫水，導(dǎo)致在蓋片下形成水珠。這些水珠可與下一步 的二甲苯結(jié)合而形成白色混濁物，這將影響組織切片的質(zhì)量。
12.二甲苯：二甲苯處理 5min。在充分脫水后，二甲苯可將組織切片上的酒精去除。去除酒 精后，在載玻片上加蓋玻片時，二甲苯也可作為包埋劑確保可溶解。由于有潛在的毒性，二 甲苯替代品，例如環(huán)烷烴也可使用。替代品可提供相同的組織染色質(zhì)量，并且他們 使用更安全，操作更簡單。 注意：當(dāng)跳過此步驟時，不使用二甲苯透明，酒精將會保存于組織切片上，導(dǎo)致伊紅從切片 上流出。
13. 封片：中性樹膠封片，自然風(fēng)干或烤干，顯微鏡觀察。
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