在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中，細胞計數(shù)是一項基礎(chǔ)且重要的實驗技術(shù)。傳統(tǒng)的細胞計數(shù)方法如血球計數(shù)板雖然直觀，但操作繁瑣且易引入誤差。相比之下，比色法，特別是MTT（3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，即噻唑藍）比色法，以其高靈敏度和經(jīng)濟性，在細胞存活和生長檢測中得到了廣泛應(yīng)用。本文將詳細介紹MTT比色法的原理、實驗步驟及其在細胞計數(shù)中的應(yīng)用。
MTT比色法原理
MTT比色法是一種基于活細胞線粒體琥珀酸脫氫酶活性的檢測方法。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源性的MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞內(nèi)。而死細胞由于缺乏此酶活性，無法形成甲瓚結(jié)晶。隨后，利用二甲基亞砜（DMSO）溶解細胞中的甲瓚結(jié)晶，并通過酶聯(lián)免疫檢測儀在特定波長（通常為490nm或570nm）下測定其光吸收值（OD值），從而間接反映活細胞的數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。
實驗步驟
1. MTT溶液的配制
材料：MTT粉末、磷酸緩沖液（PBS，pH=7.4）或無酚紅的培養(yǎng)基、0.22μm濾膜、鋁箔紙。
步驟：稱取MTT 0.5克，溶于100ml PBS中，用0.22μm濾膜過濾以除去細菌，放4℃避光保存。配制過程中，容器最好用鋁箔紙包住以避免光照分解。
2. 細胞接種與培養(yǎng)
材料：培養(yǎng)瓶、96孔板、移液管、培養(yǎng)基（含10%胎小牛血清）、胰蛋白酶等。
步驟：收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度至適當(dāng)范圍（如1000-10000個/ml），接種于96孔板中，每孔加入100-200μl細胞懸液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁或達到實驗所需狀態(tài)。
3. MTT處理與孵育
步驟：向每孔加入10μl MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。MTT被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為甲瓚結(jié)晶并沉積在細胞內(nèi)。
4. 結(jié)晶溶解與比色
步驟：終止培養(yǎng)后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液（對于懸浮細胞需先離心）。每孔加入100μl DMSO，置搖床上低速振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm或570nm波長下測定各孔的光吸收值（OD值）。
5. 數(shù)據(jù)處理與分析
步驟：記錄各孔的OD值，根據(jù)實驗設(shè)計進行數(shù)據(jù)處理和分析。通常，以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線，以反映細胞增殖情況。
應(yīng)用與注意事項
應(yīng)用
MTT比色法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等領(lǐng)域。其高靈敏度和經(jīng)濟性使得該方法成為細胞生物學(xué)研究中的重要工具。
注意事項
MTT溶液的配制與保存：MTT溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，避免反復(fù)凍融。配制好的溶液應(yīng)置于4℃避光保存，并在兩周內(nèi)使用完畢。
細胞接種濃度與培養(yǎng)時間：選擇合適的細胞接種濃度和培養(yǎng)時間對于實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。不同細胞類型的最佳接種濃度和培養(yǎng)時間可能有所不同，需通過預(yù)實驗確定。
實驗條件控制：實驗過程中應(yīng)嚴格控制培養(yǎng)條件（如溫度、CO2濃度等），以減少外界因素對實驗結(jié)果的影響。
OD值范圍：為了保證實驗結(jié)果的線性關(guān)系，MTT實驗的OD值最好在0-0.7范圍內(nèi)。超出此范圍時，OD值與細胞數(shù)之間的線性關(guān)系可能不再成立。
防止污染：實驗過程中應(yīng)注意無菌操作，避免細胞污染對實驗結(jié)果的影響。
結(jié)論
MTT比色法作為一種高效、靈敏的細胞計數(shù)方法，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。通過掌握其原理、實驗步驟及注意事項，可以更加準(zhǔn)確地進行細胞計數(shù)和生長狀況分析，為科學(xué)研究提供有力支持。
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