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新生小鼠頸上交感神經(jīng)元分散細(xì)胞培養(yǎng)
閱讀：755 發(fā)布時間：2017-3-21原代細(xì)胞交感神經(jīng)系統(tǒng)在維持機(jī)體的正常功能和對環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)中起著十分重要的作用。交感神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)特別有助于神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和可塑性研究，利用體外培養(yǎng)系統(tǒng)可進(jìn)行交感神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生、死亡、形態(tài)和生化發(fā)育、遞質(zhì)表形的獲得，以及靶組織與傳入纖維的突觸形成的研究。此外，通過體外培養(yǎng)系統(tǒng)可獲得關(guān)于神經(jīng)營養(yǎng)因子、激素，細(xì)胞因子等調(diào)節(jié)交感神經(jīng)元發(fā)育的信息，了解傳入纖維的輸入以及與靶組織的的機(jī)制。
1、材料和方法
實驗用出生當(dāng)天的昆明種小鼠，在無菌條件下腹部朝上固定于塑料泡沫板上,用微解剖鑷在解剖顯微鏡下找到氣管兩側(cè)的頸總動脈,并以此為標(biāo)志,在頸總動脈分為頸內(nèi)外動脈交叉處找到上頸交感節(jié), 取出上頸交感節(jié), 置于含 1 % 膠元酶(Collagenase)和1 % 消化酶(Dispase)的2ml混合消化液中消化(37℃， 1 h)分散后，用種植(Plating)培養(yǎng)液稀釋成0.2×105個細(xì)胞/ml密度的的細(xì)胞懸液;接種于涂有小牛皮膠或以小鼠腦皮層膠質(zhì)細(xì)胞為背景的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿2ml細(xì)胞懸液置。置標(biāo)本于36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液,改用飼養(yǎng)(Feeding)培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種第3d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48 h后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液,以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。
2、培養(yǎng)液成份
原代細(xì)胞種植培養(yǎng)液: 80%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L);10%胎牛血清;10%馬血清;NGF 20ng/ml; 谷氨酰胺100μg/ml。脫氧核糖核酸酶 I 40μg/ml。
飼養(yǎng)培養(yǎng)液: 95%Eagle's DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO3 3.7g/L,);5%馬血清; NGF 20 ng/ml;神經(jīng)營養(yǎng)素 1ml/100ml;谷氨酰胺100μg/ml。
3、新生小鼠交感節(jié)神經(jīng)元的生長分化和形態(tài)特征
新生小鼠交感節(jié)神經(jīng)元在含 NGF 的培養(yǎng)液中種植后4h, 細(xì)胞即開始貼附在膠元薄膜或在皮層膠質(zhì)細(xì)胞層上生長, 交感神經(jīng)元的胞體一般為圓形, 有時亦可見橢圓或梭形,體積較大, 直徑約8-14μm左右,胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈,神經(jīng)元的細(xì)胞核大多偏于胞體一側(cè),核仁明顯,亦可見雙核神經(jīng)元 。接種后24h, 大部分貼壁神經(jīng)元開始長出突起。培養(yǎng)2-3天后,神經(jīng)元突起逐漸增多并延長, 形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時間的延長, 神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密。神經(jīng)原代細(xì)胞的主干和分枝明顯延長并增粗, 神經(jīng)元的胞體逐漸增大。小鼠交感神經(jīng)元可維持培養(yǎng)1-2個月。