冷凍保存細(xì)胞之方法?
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20 ℃30 分鐘*) → -80 ℃16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下, 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過(guò)1 小時(shí), 以防止冰晶過(guò)大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃ 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
產(chǎn)品屬性:
產(chǎn)品名稱 | 小鼠外周血中性粒細(xì)胞 |
規(guī)格 | 5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶 |
貨號(hào) | GOY-01X1146 |
名稱 小鼠外周血中性粒細(xì)胞
2.組織來(lái)源:外周血
3.產(chǎn)品規(guī)格:5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶
4.細(xì)胞簡(jiǎn)介:
小鼠外周血中性粒細(xì)胞分離自外周血;外周血是除骨髓之外的血液,臨床上常用一些方法把骨髓中的造血干細(xì)胞釋放到血液中,再在從血液中提取分離得到造血干細(xì)胞,我們把這樣得到的干細(xì)胞稱為外周血干細(xì)胞,在二十一世紀(jì)初人類開(kāi)始的生命方舟計(jì)劃中提出外周血這一新概念。白細(xì)胞是一類無(wú)色、球形、有核的血細(xì)胞。白細(xì)胞不是一個(gè)均一的細(xì)胞群,根據(jù)其形態(tài)、功能和來(lái)源部位可以分為三大類:粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,其中粒細(xì)胞又可根據(jù)胞質(zhì)中顆粒的染色性質(zhì)不同,分為中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞三種。中性粒細(xì)胞是在瑞氏(Wright)染色血涂片中,胞質(zhì)呈無(wú)色或極淺的淡紅色,有許多彌散分布的細(xì)小的(0.2~0.4微米)淺紅或淺紫色的*顆粒。細(xì)胞核呈桿狀或2~5分葉狀,葉與葉間有細(xì)絲相連。中性粒細(xì)胞具趨化作用、吞噬作用和殺菌作用。中性粒細(xì)胞來(lái)源于骨髓,具有分葉形或桿狀的核,胞漿內(nèi)含有大量既不嗜堿也不嗜酸的中性細(xì)顆粒。這些顆粒多是溶酶體,內(nèi)含髓過(guò)氧化酶、、堿性磷酸酶和酸性水解酶等豐富的酶類,與細(xì)胞的吞噬和消化功能有關(guān)。中性粒細(xì)胞在血液的非特異性免疫中起著十分重要的作用,它處于機(jī)體抵御微生物病原體,特別是在化膿性細(xì)菌入侵的線,具有很強(qiáng)的吞噬活性,可吞噬細(xì)菌、衰老的紅細(xì)胞、抗原一抗體復(fù)合物和壞死的細(xì)胞等。中性粒細(xì)胞內(nèi)含有大量溶酶體酶,因此能將吞噬入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌和組織碎片*分解。當(dāng)中性粒細(xì)胞吞噬數(shù)十個(gè)細(xì)菌后,自身發(fā)生解體,所釋出的各種溶酶體酶類能溶解周圍組織而形成膿液。中性粒細(xì)胞是人體內(nèi)壽命短的細(xì)胞,一般體外培養(yǎng)12-24h內(nèi)活性穩(wěn)定,48h活性下降,96h基本死亡。
5.方法簡(jiǎn)介:
公司實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠外周血中性粒細(xì)胞采用取外周血、通過(guò)密度梯度離心法制備而來(lái),細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
6.質(zhì)量檢測(cè):
公司實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠外周血中性粒細(xì)胞經(jīng)瑞氏染色法,純度可達(dá)90%以上,且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。
7.培養(yǎng)信息:
培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等
換液頻率 每2-3天換液一次
生長(zhǎng)特性 懸浮
細(xì)胞形態(tài) 圓形
傳代特性 不增殖;不傳代
消化液 0.25%
培養(yǎng)條件 氣相:空氣,95%;CO2,5%
培養(yǎng)操作:
1)復(fù)蘇細(xì)胞:將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍,加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘,棄去上清液,補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過(guò)夜(或?qū)?/span> 細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中,加入約 8ml 培養(yǎng)基,培養(yǎng)過(guò)夜)。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度。
2)細(xì)胞傳代:如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養(yǎng)瓶中,置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分 變圓并脫落,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基,輕輕打勻后吸出,在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘,棄去上清液,補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細(xì)胞懸液按 1:2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí),可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類;
1. 細(xì)胞凍存時(shí),棄去培養(yǎng)基后,PBS 清洗一遍后加入 1ml ,細(xì)胞變圓 脫 落后,加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化,可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO,輕輕混勻,DMSO 終濃度為 10%,細(xì)胞密度不低于1x106/ml,每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液,注意凍 存管做好標(biāo)識(shí)。
3. 將凍存管置于程序降溫盒中,放入-80 度冰箱,2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
平蓋靈芝(樹(shù)舌) 0.5%葡萄糖肉湯100ml
異常漢遜酵母 涇陽(yáng)鏈霉菌
甲型副傷寒沙門菌凍干粉 肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種
清酒乳桿菌清酒亞種 亞膜漢遜酵母
發(fā)酵纖維單胞菌 漢遜德巴利酵母
大鼠載脂蛋白B-48(ApoB48)elisa檢測(cè)試劑盒
大鼠載脂蛋白B48(Apo B48)elisa檢測(cè)試劑盒
大鼠載脂蛋白B100(apo-B100)elisa檢測(cè)試劑盒
大鼠載脂蛋白B100(Apo B100)elisa檢測(cè)試劑盒
大鼠載脂蛋白A5(apo-A5)elisa檢測(cè)試劑盒
小鼠外周血中性粒細(xì)胞人高密度脂蛋白(HDL)elisa分析檢測(cè)試劑盒
人高密度脂蛋白1(HDL1)elisa分析檢測(cè)試劑盒
人高密度脂蛋白2(HDL2)elisa分析檢測(cè)試劑盒
人高密度脂蛋白3(HDL3)elisa分析檢測(cè)試劑盒
人高密度脂蛋白(HDL-C)elisa分析檢測(cè)試劑盒
實(shí)驗(yàn)報(bào)告:
產(chǎn)品僅用于科研一、分離與培養(yǎng):
1、無(wú)菌條件下,取出1-3d 齡SD大鼠心房組織,然后用PBS將此組織塊清洗2次,后將成1mm3左右大小;
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液(0.1% 和0.1% I型膠原酶),混懸10s,置37℃條件下消化10min,之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置;
3、剩下的組織再加入3~4mL酶消化液,混懸10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置,重復(fù)此步驟2-3次,直至組織*被消化;
4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液,1200r/min 離心10min,棄去上清,沉淀細(xì)胞用含有10% FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸,接種于25cm2培養(yǎng)瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
5、差速貼壁1h后,吸出培養(yǎng)基,按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng);
二、免疫熒光鑒定:
1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),棄去培養(yǎng)基,用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min;
2、PBS沖洗細(xì)胞2次,每次10min,然后在4℃條件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;
3、PBS沖洗細(xì)胞2次,每次10min,然后在室溫條件下,用4% BSA封閉細(xì)胞30min;
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗,然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜;
5、PBS沖洗細(xì)胞3次,每次10min,按1:150的比例稀釋抗α-actin的二抗, 37℃條件下放置1h;
6、用PBS沖洗3次,每次10min,后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。