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大鼠elisa檢測(cè)試劑盒制取質(zhì)粒的過(guò)程
閱讀：177 發(fā)布時(shí)間：2018-10-18 大鼠elisa檢測(cè)試劑盒我們知道，質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。分離與提取是zui常用、zui基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
它的制取方法有很多的，一般情況下來(lái)，大多都是包括了細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化這三個(gè)步驟。而今天給朋友們講說(shuō)的實(shí)驗(yàn)中，是以以堿裂解法為例，其中，我們要掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。
所需物品：
1、含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液
2、克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液
取過(guò)程
1、取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LA培養(yǎng)基上37℃過(guò)一個(gè)晚上培養(yǎng)；
2、用無(wú)菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床~250 r/min過(guò)一個(gè)晚上培養(yǎng)；
3、吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈；
4、加入300 ml溶液 I振蕩打勻,重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（這里的時(shí)候，上海恒遠(yuǎn)提醒注意：應(yīng)*打勻沉淀或碎塊）；
5、加入300 ml溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過(guò)5分鐘；
6、加入300 ml溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀；
7、12000 g離心10分鐘；
8、吸取800 ml上清液（注意！不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘；
9、12000 g 常溫離心15分鐘；
10、倒盡上清，加75％乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）；
11、室溫放置或超凈臺(tái)上風(fēng)干DNA；
12、加40 ml滅菌超純水或TE溶解；
13、質(zhì)粒、BAC的質(zhì)量檢測(cè)，于-20℃保存.
我們這個(gè)實(shí)驗(yàn)的主要原理依據(jù)是在pH 12.0 ~ 12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開(kāi)，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài).通過(guò)離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。