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ATCC細胞培養(yǎng)及外源基因?qū)氲膶嶒灢襟E
閱讀：458 發(fā)布時間：2017-12-12ATCC細胞的傳代培養(yǎng)（*天）
1) 顯微鏡觀察母細胞的生長狀態(tài)，確定傳代比例。
為了獲得較高的轉染效率，必需保證細胞處于合適的生長密度，因此應根據(jù)母細胞的生長密度調(diào)整傳代比例。磷酸鈣轉染的合適細胞密度為50％－70%，本實驗中使用的293細胞長成致密單層后一般按照1：6傳代即可。
2) 在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿蓋，倒去皿中的細胞營養(yǎng)液，加入2mlHank’s液，輕輕搖動，將溶液倒出。
3) 消化與分裝。
在培養(yǎng)皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液），37°C靜置5分鐘左右，顯微鏡觀察，如果細胞變圓且彼此分離表明消化*，此時可加入10ml營養(yǎng)液終止消化，吹打數(shù)次，使培養(yǎng)皿壁上的細胞全部脫落下來，并分散形成均勻的細胞懸液。按照傳代的比例補加適當體積的營養(yǎng)液，吹打混勻后分裝到新的培養(yǎng)皿中。
在分裝好的細胞培養(yǎng)皿上做好標記，置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2. 用磷酸鈣介導的外源質(zhì)粒轉染法在293細胞中過量表達TNF－R1（第二天）
1) 顯微鏡觀察待轉染細胞的生長狀態(tài)
a. 觀察細胞是否污染
b. 觀察培養(yǎng)液顏色的變化
c. 觀察細胞的生長密度
2) 轉染
a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）質(zhì)粒DNA（實驗組為TNF-R1的哺乳動物細胞表達載體，對照組為空載體），350μl超純水，40μlCaCl2(2.5M)溶液，混勻。
b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS，將A液分三次緩慢加入，每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。
c. 將A，B混合液均勻地滴加在待轉染的293細胞培養(yǎng)液中，輕輕晃動使混勻。將培養(yǎng)皿置于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中。
3. ATCC細胞的形態(tài)觀察，“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析（第三天）
1) 顯微鏡觀察過量表達TNF-R1（實驗組）和空載體（對照組）的293細胞形態(tài)上的差異。
2) 用10ml玻璃吸管將實驗組和對照組培養(yǎng)皿中的細胞輕輕吹打下來，收集到15ml離心管中，2000rpm離心5分鐘，沉淀用1mlPBS重懸，轉移到1.5ml離心管中，2000rpm離心3分鐘，去除上清液，加入200μlPBS(0.2mg/ml 蛋白酶 K)，重懸細胞，再加入200μlPBS（2％NP40），顛倒混勻，4°C作用30分鐘，期間顛倒數(shù)次。12,000rpm離心2分鐘，吸出上清，加入1ml乙醇，顛倒混勻，－20°C靜置10分鐘，12,000rpm離心10分鐘，沉淀溶于50μl水中，加入RNaseA(10mg/ml)，37°C靜置20分鐘。
3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液，取出50μl進行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。
100mg 130409-201011 阿莫西林 含量測定
100mg 130410-200706 氨芐西林 含量測定
100mg 130411-200307 新霉胺 雜質(zhì)檢查
50mg 130412-200902 頭孢哌酮S異構體 系統(tǒng)適應性
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50mg 130414-8702 3-甲基利福霉素SV 檢查
50mg 130415-200904 α-苯甘氨酸 雜質(zhì)檢查
50mg 130416-201006 7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸 雜質(zhì)檢查
100mg 130417-8701 無味氯霉素A晶型 檢查
ATCC細胞