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        1. 上海仁捷生物科技有限公司

          豚鼠免疫球蛋白E(IgE)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)說明書

          時(shí)間:2018-3-5閱讀:1509

          豚鼠免疫球蛋白EIgE酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

          試劑盒使用說明書

          本試劑僅供研究使用       目的:本試劑盒用于測定豚鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中免疫球蛋白E(IgE)的含量。

           

          實(shí)驗(yàn)原理

          本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本豚鼠免疫球蛋白E(IgE)水平。用純化的豚鼠免疫球蛋白E(IgE)捕獲抗體包被微孔板,制成固相體,往包被的微孔中依次加入豚鼠免疫球蛋白E(IgE),再與HRP標(biāo)記的檢測抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的豚鼠免疫球蛋白E(IgE)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品豚鼠免疫球蛋白E(IgE)含量。

           

          試劑盒組成

          試劑盒組成

          48孔配置

          96孔配置

          保存

          說明書

          1份

          1份

           

          封板膜

          2片

          2片

           

          密封袋

          1個(gè)

          1個(gè)

           

          酶標(biāo)包被板

          1×48

          1×96

          2-8℃保存

          標(biāo)準(zhǔn)品

          0.3ml×6管

          0.3ml×6管

          2-8℃保存

          酶標(biāo)試劑

          5 ml×1瓶

          10 ml×1瓶

          2-8℃保存

          樣品稀釋液

          3 ml×1瓶

          6 ml×1瓶

          2-8℃保存

          顯色劑A液

          3 ml×1瓶

          6 ml×1瓶

          2-8℃保存

          顯色劑B液

          3 ml×1瓶

          6 ml×1瓶

          2-8℃保存

          終止液

          3 ml×1瓶

          6 ml×1瓶

          2-8℃保存

          20×濃縮洗滌液

          15ml×1瓶

          25ml×1瓶

          2-8℃保存

          注:標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為:240、120、60、30、15、0 μg/mL.

           

          樣本處理及要求

          1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

          2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。

          3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

          4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時(shí),用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

          5. 組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

          6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

          7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

           

          操作步驟

          • 標(biāo)準(zhǔn)品的加樣:設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;。
          • 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
          • 加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑100μl,空白孔除外。
          • 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
          • 配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
          • 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
          • 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘. 
          • 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)
          • 測定:以空白孔調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值) 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

           

          注意事項(xiàng):

          • 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
          • 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果。
          • 各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
          • 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計(jì)算時(shí)請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
          • 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
          • 底物請避光保存。
          • 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
          • 所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
          • 本試劑不同批號組分不得混用。

          10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準(zhǔn)。

           

           

           

          計(jì)算

          以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),    

          在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD      

          值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋      

          倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)      

          準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值      

          代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋      

          倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。                  

                                                       

          (此圖僅供參考)

           

           

           

          試劑盒性能:

          1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。

          2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% 。

           

          檢測范圍:                                              

          7.5 μg/mL - 240 μg/mL

           

          靈敏度:                                              

          zui低檢測濃度小于1.0 μg/mL

           

          保存條件及有效期:

          1.試劑盒保存: 2-8

          2.有效期: 6個(gè)月

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