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        1. 上海仁捷生物科技有限公司

          透明質(zhì)酸(HA)ELISA試劑盒操作方法

          時(shí)間:2018/8/16閱讀:1678

          鴨透明質(zhì)酸(HA)ELISA試劑盒僅供研究使用

           

          鴨透明質(zhì)酸(HA)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

          本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣本中鴨透明質(zhì)酸(HA)的含量。

          有效期:6個(gè)月

          保存條件:2-8℃

           

           

           

          實(shí)驗(yàn)原理

          試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被鴨透明質(zhì)酸(HA)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的鴨透明質(zhì)酸(HA)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計(jì)算樣品濃度。

           

           

           

          鴨透明質(zhì)酸(HA)ELISA試劑盒組成

          試劑盒組成96孔配置48孔配置備注
          微孔酶標(biāo)板8孔×12條8孔×6條 無
          標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL×6管0.3mL×6管
          樣本稀釋液6mL3mL
          檢測抗體-HRP10mL5mL
          20×洗滌緩沖液25mL15mL按說明書進(jìn)行稀釋
          底物A6mL3mL
          底物B6mL3mL
          終止液6mL3mL
          封板膜2張2張
          說明書1份1份
          自封袋1個(gè)1個(gè)

          備注:

          1. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為:200、100、50、25、12.5、0 ng/mL

          2. 經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn),標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí),可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

           

           

           

          樣本處理及要求

          1. 血清:全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

          2. 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

          3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:1000g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

          注:標(biāo)本溶血會(huì)影響后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

           

           

           

          需要而未提供的試劑和器材

          1. 酶標(biāo)儀(450nm)

          2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

          3. 37℃恒溫箱

          4. 蒸餾水或去離子水

           

           

           

          試劑準(zhǔn)備

          試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

          20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

           

           

           

          操作步驟

          1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

          2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;

          3. 樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加。

          4. 除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

          5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。

          6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

          7. 每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。

           

           

           

          注意事項(xiàng)

          1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

          2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

          3. 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。

          4. 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

          5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。

          6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

          7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

          8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

          9. 不能使用過期產(chǎn)品。

          10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

           

           

           

          洗板方法

          手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用。根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。

          自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

           

           

           

          實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

          以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得到直線回歸方程,將樣品的OD值代入方程,計(jì)算出樣品的濃度。

          Elisa試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

          (此圖僅供參考)

           

           

           

          鴨透明質(zhì)酸(HA)ELISA試劑盒性能

          1. 檢測范圍:6.25 ng/mL – 200 ng/mL。

          2. 靈敏度:低檢測濃度小于1.0 ng/mL。

          3. 特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

          4. 重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,板間變異系數(shù)小于15% 。

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