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          PCR技術(shù)的基本原理

          閱讀:1711      發(fā)布時(shí)間:2019-10-30
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          PCR技術(shù)的基本原理
          聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。因此,無(wú)論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所的毛發(fā)、皮膚或血液,只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA,就能用PCR加以放大,進(jìn)行比對(duì)。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。由1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想,1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法,意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到如今2013年,PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。1976年,中國(guó)科學(xué)家錢嘉韻,發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶,為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn)。
          PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈,低溫(經(jīng)常是60°C左右)時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合,再調(diào)溫度至DNA聚合酶適反應(yīng)溫度(72°C左右),DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈?;诰酆厦傅腜CR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備,能在變性溫度,復(fù)性溫度,延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。
          PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;③引物的延伸:DNA模板-引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

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