全程請(qǐng)戴手套操作,以免污染伯樂轉(zhuǎn)印槽!
1)電泳后SDS-PAGE 膠片浸在轉(zhuǎn)印緩沖液中,洗2~3 次,每次10min.
2)取出伯樂轉(zhuǎn)印槽,先小心放一攪拌子在底部,再倒一半轉(zhuǎn)印緩沖液。
3)取轉(zhuǎn)印紙切成約如膠片大小,先在方形培養(yǎng)皿中以少許甲醇浸濕數(shù)秒鐘,再置入伯樂轉(zhuǎn)印槽中的緩沖液10 min 后使用。 另取兩張濾紙,以及兩片方形海綿墊,都放在伯樂轉(zhuǎn)印槽的緩沖液中備用。
4)取出轉(zhuǎn)印夾打開平放,先墊一張方形海棉墊,鋪上一張濕濾紙,小心平鋪SDS-PAGE膠上去,然后小心迭上已潤(rùn)濕的轉(zhuǎn)印紙,用涂菌玻璃棒趕出氣泡;轉(zhuǎn)印紙?jiān)俚紊蠑?shù)滴緩沖液后,加蓋一層濾紙,及另一張海綿,也都不可陷入氣泡,即可把整個(gè)轉(zhuǎn)印三明治卡夾裝好。
膠迭到轉(zhuǎn)印紙時(shí),一次成功,不要重作,否則蛋白質(zhì)色帶可能會(huì)印上去,后產(chǎn)生重迭影像。
5)將轉(zhuǎn)印三明治置入已經(jīng)放有一半轉(zhuǎn)印緩沖液的伯樂轉(zhuǎn)印槽中,注意有轉(zhuǎn)印紙的那一面向正極(紅色),膠片那面向負(fù)極(黑色)。
6)當(dāng)三明治都放入伯樂轉(zhuǎn)印槽后,以轉(zhuǎn)印緩沖液蓋滿所有的三明治,小心動(dòng)一動(dòng)卡夾,除去附在卡夾內(nèi)外的氣泡,蓋上蓋子,放到一攪拌器上,打開攪拌器開始攪拌,同時(shí)接好電源,裝置完成后放置10 min.
7)以300mA開始轉(zhuǎn)印,溫度會(huì)漸漸上升,轉(zhuǎn)印1.5 h左右 后中止轉(zhuǎn)印,取出轉(zhuǎn)印三明治,打開后依次取出轉(zhuǎn)印紙及膠。
具體轉(zhuǎn)印條件要根據(jù)蛋白的大小進(jìn)行優(yōu)化,注意低溫。
8)轉(zhuǎn)印后的膠片可以繼續(xù)進(jìn)行染色,看有無蛋白質(zhì)殘留。若電泳時(shí)加有藍(lán)色標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker(SeeBlue),則可在轉(zhuǎn)印紙上看到藍(lán)色的色帶,確定轉(zhuǎn)印成功,并可評(píng)估轉(zhuǎn)印效率。