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產品簡介

供貨周期	一個月以上	應用領域	醫(yī)療衛(wèi)生,生物產業(yè)

可用于活細胞的不可逆GST抑制劑
CNBSF ＜Irreversible GST Inhibitor＞
CNBSF（2-chloro-5-nitrobenzensulfonyl fluoride）是針對谷胱甘肽 S-轉移酶（GST）的不可逆性抑制劑。與目前已知的作為GST抑制劑廣泛使用的利尿酸相比，抑制活性明顯更高，且因其不可逆性，可長期保持GST失活。

詳細介紹

可用于活細胞的不可逆GST抑制劑

CNBSF ＜Irreversible GST Inhibitor＞

CNBSF（2-chloro-5-nitrobenzensulfonyl fluoride）是針對谷胱甘肽 S-轉移酶（GST）的不可逆性抑制劑。與目前已知的作為GST抑制劑廣泛使用的利尿酸相比，抑制活性明顯更高，且因其不可逆性，可長期保持GST失活。

※ 本產品基于名古屋大學理科研究科阿部洋教授的研究成果商品化而成。

※ 本產品僅供研究，研究以外不可使用。

添加CNBSF至HeLa細胞中不可逆地抑制細胞內的GST后，使用用于活細胞的GST活性檢測探針DNs-Rh（#FDV-0030）觀察殘留的GST活性。可發(fā)現， CNBSF的添加顯著地抑制了細胞內GST的酶活性。

◆GST以及抑制劑的含義

谷胱甘肽S-轉移酶（GST）家族是廣泛存在于細菌和動植物的酶家族，具有在細胞內將疏水性外源性物質（xenobiotics）結合到谷胱甘肽（GSH）中并轉換為GSH共軛物（GSH-conjugate）的活性。MRP（multidrug resistance-associated protein）轉運蛋白積極地將GSH共軛物釋放到細胞外，有著去除雜質的功能。因此，GST作為解毒因子，將可能成為細胞毒素的外來化合物排出細胞而起作用。

另一方面，由于大多數抗癌藥等藥物也會通過GST轉換為GSH共軛物排出細胞外，因此GST作為耐藥因子，也呈現出了降低藥效的負面影響。尤其是隨著癌癥的惡化，特定GST亞型（GSTP1）的表達水平增強，由此可推斷出癌細胞獲得了強耐藥性。雖然可以期待通過抑制GST活性提高抗癌藥在細胞內的滯留性，然而迄今使用的GST抑制物質并不完善。傳統(tǒng)的GST抑制物質主要使用與GSH競爭抑制的競爭性抑制物質。然而，盡管這些競爭性抑制物質在體外實驗中展現出色的抑制活性，但從細胞內的情況來看，GSH濃度約為數毫摩爾便算是*濃度，在細胞內引發(fā)競爭、獲得充分的抑制效果是十分困難的。

◆新型GST抑制策略 BSF抑制劑

名古屋大學的阿部洋教授等人使用benzensulfonyl fluoride（BSF）基作為新的GST抑制策略，致力于制造在細胞內的不可逆性抑制物質，并在后成功開發(fā)出在活細胞內呈現出色抑制活性的CNBSF ¹^）。CNBSF擁有細胞膜穿透性，進入細胞后與GST的雜質識別部位H-site結合。GSH與GST的G-site結合，CNBSF在GST的蛋白內部附著到GSH上轉換為GSH共軛物（GS-5NBSF），而GS-5NBS立刻與GST的Tyr108（GSTP_1-1時）發(fā)生不可逆反應。這個反應使GS-BSF無法從GST上脫離，并且由于堵塞了H-site、G-site，使GST失活。與傳統(tǒng)競爭性抑制物質相比，這個方法能夠使GST不可逆性地失活，達到長期抑制的效果。

◆詳細原理

■　抑制反應機構模型（以GSTP_1-1為例）

1.　CNBSF和GSH分別與GST的H-site、G-site結合，GST的酶活性依賴GSH的硫醇根陰離子與CNBSF反應。

1.　CNBSF的氯離子CI^-作為離去基團而脫離。

2.　在GST酶內生成GS-5NBSF。

3.　在GS-5NBSF的benzensulfonyl fluoride基中GSTP_1-1與Tyr108發(fā)生羥基反應。

4.　伴隨著氟離子F⁻的脫離，GST與GS-5NBSF通過共價鍵交聯(lián)。

◆特點

●　擁有膜穿透性，可用于活細胞

●　在細胞內通過GST附著于GSH，作為GST抑制物質發(fā)揮功能

●　因為是不可逆性抑制物質，可長期抑制。另外，不同于傳統(tǒng)的可逆性化合物，在清洗后仍然保持抑制作用

●　與已知GST抑制物質ethacrynic acid（EA）相比，在活細胞實驗中呈現高抑制活性

●　可與廣泛的GST家族反應

●　經質譜確認本產品與內源性GST（GSTP1-1）共價結合

◆原著文獻

1. Shishido, Y., et al., ChemBioChem. (in press),

1. "A covalent inhibitor for Glutathione S-Transferase Pi (GSTP1-1) in human cells."

◆應用實例

■　不可逆性GST抑制活性

使用GSTP_1-1重組體在體外實驗評價抑制活性。GSTP_1-1在含有0.1 mM抑制物質的情況下于37°C反應2小時，在有和無超濾清洗后，使用1 μM的GST活性檢測探針DNs-Rh（#FDV-0030）評價GST活性。從清洗后GST活性恢復可知，ethacrynic acid（EA）是可逆性抑制物質，從CNBSF清洗后仍保持抑制活性來看，CNBSF對GST的抑制是不可逆的。

■　活細胞中GST的抑制活性

用胰蛋白酶脫離NCI-H522細胞使其懸浮，然后添加1 mM的抑制物質在37°C下孵育15分鐘。用PBS清洗細胞后，添加2.5 μM DNs-Rh（#FDV-0030），在37°C下反應1小時。然后再次使用PBS清洗細胞，去除未反應的試劑后，用流式細胞儀（Ex 490/Em 520 nm）定量。添加了CNBSF的細胞中，GST活性幾乎*消失，而且效果更甚于EA。