試劑

包裝

ProteoStar™ Aggresome Detection Reagent

10 μL

Hoechst 33342 Nuclear Stain

50 μL

Proteasome Inhibitor (MG-132)

120 nM

10X Assay Buffer

25 mL

用0.2% DMSO模擬培育Jurkat細(xì)胞或在37℃下用 5 µM的MG-132過(guò)夜培育。用熒光素p62 Ab (1:500稀釋原液)培育細(xì)胞。清洗細(xì)胞后，通過(guò)流式細(xì)胞儀在FL1信道使用488 nm的激光進(jìn)行分析。在MG132處理的細(xì)胞時(shí)，熒光素p62 Ab的抗體信號(hào)增加約2.5倍。

　　用5 μM MG-132培育帶有HeLa細(xì)胞的聚集小體12小時(shí)后（右圖），加入ProteoStat^® 聚集小體染料（紅色）和用Hoechst33342復(fù)染，然后進(jìn)行觀察。未經(jīng)培育的聚集小體（左圖）。

　　預(yù)先用5μMMG-132培育帶有HeLa細(xì)胞的聚集小體12小時(shí)后，用ProteoStat^® 聚集小體染料來(lái)染色觀察（左上圖綠色部分）；與AlexaFluor^® 647微管蛋白抗體（左下圖紅色部分）共定位；通過(guò)熒光顯微鏡觀察的合成圖像（右圖）。

　　α-syn混合物形式聚集在被內(nèi)化到M17神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的細(xì)胞質(zhì)膜。用α-syn單體處理M17細(xì)胞，聲波處理α-SIGN PFFs或α-SYN混合物（M + F）。四天后，在固定M17細(xì)胞前，將其清洗3次，用 PROTEOSTAT^® 聚合染料（綠色）染色和用抗α-syn（紅）和β連環(huán)蛋白（灰色）免疫染色。比例尺= 20 µm。作者提到“Fibril生長(zhǎng)和播種量α-synuclein蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。”

在PROTEOSTAT^® 聚集小體檢測(cè)試劑（A）和Hoechst 33342核染色（B）的激發(fā)和發(fā)射光譜。

　　由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的自噬細(xì)胞產(chǎn)生的聚集小體和聚集小體類的包涵體，epi-熒光顯微成像圖。未經(jīng)處理的K562細(xì)胞（A）；加入5 mM MG-132溶液培育24小時(shí)（B）；加入50 mM CQ培育24小時(shí)（C）；加入100 nM毒胡蘿卜素（D）。在溫室下，用PROTEOSTAT^® 染料(1:10,000稀釋)來(lái)固定染色細(xì)胞30分鐘。PROTEOSTAT^® 的著色顯示 聚集體 和 ALIS呈紅色， DAPI 呈藍(lán)色。

　　分別25，50，75 mmCQ，100 nM的毒胡蘿卜素（TG）或5mM的MG-132處理K562細(xì)胞24小時(shí)。然后在溫室下用PROTEOSTAT^® 染料（1：10,000稀釋）固定并透化培育細(xì)胞30分鐘。接著在BD LSR II的藍(lán)色610/20 nm的信道分析細(xì)胞（30,000）。

　　分別使用毒胡蘿卜素（Tg，0.1 μM），25，50和75微米氯喹（CQ）處理K562 細(xì)胞24小時(shí)，來(lái)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和不*自噬細(xì)胞。采用陽(yáng)性對(duì)照，加入蛋白酶體抑制劑，鎂 132 (5 µM)培育 24小時(shí)。固定并透化沉淀的細(xì)胞。接著根據(jù)說(shuō)明書的指示，在室溫下用 300 µL PROTEOSTAT^® 聚集小體檢測(cè)試劑盒 （Enzo Life Sciences）培育細(xì)胞30分鐘，加入1 mg/L DAPI （用來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期）。S值聚集小體小傾向的因子（APF）相對(duì)增加，G1和G2m的S值是通過(guò)每次細(xì)胞處理后檢測(cè)的結(jié)果和對(duì)照組相比而得出。S期和G1相比，ER 應(yīng)激誘導(dǎo)劑、Tg和 50 µM CQ的聚集小體數(shù)量呈上升趨勢(shì)，同時(shí)顯示蛋白酶體抑制劑，MG-132和50μMCQ下降的聚集小體數(shù)量在G2M S期比對(duì)照水平更低。

ProteoStat^® Aggresome detection kit

ProteoStat^® 蛋白聚集小體檢測(cè)試劑盒