GV3101 Electroporation-Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格 

GV3101 Elec：                                                             50μl/支
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl )                    10μl
保存條件(保質(zhì)期)：                                         -80℃（12個月） 

基因型

C58 (rif^R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gent^R) Nopaline

GV3101 Electroporation-Competent Cell產(chǎn)品說明

GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質(zhì)粒含有篩選標簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。開發(fā)的GV3101電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒 (size:11633 bp)檢測轉(zhuǎn)化效率>10⁵ cfu/μg DNA；經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質(zhì)粒 (size:40 kd)檢測轉(zhuǎn)化效率可達5×10³ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（體積不大于6ul，感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高，次使用前做預(yù)實驗確定所加質(zhì)粒的量），用手管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?，蓋上杯蓋，空管保留待用。

3. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天

（當平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。