人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子GMCSF試劑盒

本試劑盒采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法，用于體外定量分析人血清、血漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清中GM-CSF的含量。預先包被的抗體和檢測相抗體都是親和純化的GM-CSF多克隆抗體。檢測相抗體經(jīng)生物素標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經(jīng)過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GM-CSF呈正相關(guān)。

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因(GM-CSF)。初定性為支持單核-巨噬細胞克隆形成的生長因子。炎癥和細胞因子的刺激，使很多細胞都能產(chǎn)生該因子，如T、B淋巴細胞，巨噬細胞，肥大細胞，內(nèi)皮細胞等。GM-CSF對內(nèi)皮細胞和造血干細胞也有作用。對一些腫瘤細胞有刺激作用。本試劑盒所用的標準品為重組人的GM-CSF，126個氨基酸，分子量15KDa。

主要參數(shù)：
檢測指標：GM-CSF；CSF2
檢測范圍：15.6pg/ml～1000pg/ml
特異性：系統(tǒng)和其它細胞因子無交叉反應
敏感性：＜1pg/ml

試劑盒組成：

儲存條件：2-8℃（頻繁使用時），-20℃（長時間不用時）。
有效期：6個月(4℃)；12個月（-20℃）。

需要而未提供的試劑和器材：
1.標準規(guī)格酶標儀。
2.自動洗板機。
3.恒溫箱
4.系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器。
5.干凈的試管和Eppendof管。
6.用去離子水將25X洗滌緩沖液稀釋25倍，成1X洗滌緩沖液。

注意事項：
1.使用前TMB顯色液應為無色透明溶液，若發(fā)現(xiàn)顏色異常，請及時與廠家聯(lián)系。
2.用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
3.要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活。
4.為免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和試管。
5.禁止混用不同批次試劑盒內(nèi)的試劑。
6.本公司提供的96孔酶標板是單條可拆型酶標板，用戶可按需求使用；剩余的酶標板請按保存條件貯存。
7.揭封板膜和覆蓋封板膜時應避免用力過大導致液體濺出。

洗板方法：
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將1X洗滌緩沖液至少300μL注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

樣品的準備和保存
樣品如果不立即分析，應分裝后冷凍保存，且避免反復凍融。

血清：用干凈試管收集血液，凝固2小時后離心1000×g 10分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
血漿：采用EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝，抽血后30分鐘內(nèi)離心1000×g 10分鐘。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
細胞培養(yǎng)上清：離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
細胞裂解液：對于貼壁細胞，去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入適量裂解液，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常10秒后，細胞就會被裂解。對于懸浮細胞，離心收集細胞，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入適量裂解液，用槍吹打把細胞吹散，用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后，10000—14000g離心3-5分鐘，取上清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

樣品稀釋的一般原則
用戶須估計樣品待測因子的含量，決定適當?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的檢測范圍。根據(jù)待測因子含量高、中、低的不同，分別采取不同的稀釋方案：

高：指待測因子在10-100ng/ml。一般按1：100稀釋。297μL樣品稀釋液加3μL樣品。
中：指待測因子在1-10ng/ml。一般按1：10稀釋。225μL樣品稀釋液加25μL樣品。
低：指待測因子在15.6 –1000pg/ml。按1：2稀釋。100μL樣品稀釋液加100μL樣品。
特低：指待測因子≤15.6pg/ml。樣品一般不做稀釋，或按1：2稀釋。

以上方案僅供參考，樣品的稀釋應有詳細記錄。

試劑的準備和保存：
A.GM-CSF標準品的稀釋和使用：在使用前2小時內(nèi)準備。
試劑盒提供2管標準品，每管10ng，每次使用1管。
1．配制10,000pg/ml標準品：取1ml樣品稀釋液加入標準品管內(nèi)，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解。
2．配制1000pg/ml標準品：取100μL 10,000pg/ml的標準品加入有0.9ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻，做上標記。
3．配制500pg/ml→15.6pg/ml標準品：準備6只Eppendorf管，每管加0.3ml樣品稀釋液，分別標記上500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml。取0.3ml 1000pg/ml的標準品加入標記500pg/ml的管中，混勻后同樣取出0.3ml，加入下一只管中。余同此類推，直到后一只樣品管。
注意：已經(jīng)稀釋的標準品（10,000pg/ml），應在12小時內(nèi)使用。-20℃冷凍保存條件下，2天內(nèi)可以使用，但不得反復凍融。
B.生物素標記抗人GM-CSF抗體工作液：在使用前2小時內(nèi)準備。
1．根據(jù)每孔需要100μL計算總的用量（實際配制時應多配制100-200μL）。
2．按1μL生物素標記抗人GM-CSF加抗體稀釋液99μL的比例配制工作液。輕輕混勻。
C.親和素-過氧化物酶復合物（ABC）工作液的準備：在使用前1小時內(nèi)準備。
1．根據(jù)每孔需要100μL計算總的用量（實配時應多配制100-200μL）。
2．按1μL親和素-過氧化物酶復合物（ABC）加ABC稀釋液99μL的比例配制工作液。輕輕混勻。

操作程序：
已稀釋好的ABC和TMB顯色液在加入酶標板孔前都應預先在37℃中平衡至少30分鐘。試劑或樣品稀釋時，切不可忘記混勻。每次檢測都應該做標準曲線。用戶須估計樣品待測因子的含量，決定適當?shù)南♂尡稊?shù)。

1.確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數(shù)目，并增加1孔作為TMB空白顯色孔。總數(shù)=樣品數(shù)+9；做雙份檢測時×2。其余重包裝好放入冰箱中。
2.將1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的標準品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。對于人血清、血漿、細胞裂解液、細胞培養(yǎng)上清，直接加已用樣品稀釋液稀釋的樣品100μL。
3.酶標板加上封板膜，37℃反應90分鐘。
4.反應后用自動洗板機吸去酶標板內(nèi)的液體；或甩去酶標板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾下。不洗。
5.將準備好的生物素抗人GM-CSF抗體工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白顯色孔除外）。酶標板加上封板膜，37℃反應60分鐘。
6.1X洗滌緩沖液洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右（每孔洗液至少300μL）。
7.將準備好的ABC工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白顯色孔除外）。酶標板加上封板膜，37℃反應30分鐘。
8.1X洗滌緩沖液洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右（每孔洗液至少300μL）。
9.按每孔90μL依次加入TMB顯色液，37℃避光反應15-20分鐘
（注意：顯色時間供參考，因用戶實驗室條件差異，顯色時間會有所不同。此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯）。
10.按每孔100μL依次加入TMB終止液，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。
11.用酶標儀在450nm測定O.D.值。
有兩種設定空白對照的方案：
（1）將TMB空白顯色孔(只加TMB顯色液和終止液)設為對照。所有的標準品和樣品的吸光值減去TMB空白顯色孔的吸光值后，在坐標紙上畫出曲線，以吸光值作為縱坐標，以濃度作為橫坐標。
（2）將零孔設為對照。所有的標準品和樣品的吸光值減去零孔的吸光值后，得到的數(shù)據(jù)可以直接在坐標紙上畫出曲線。
12.根據(jù)樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了N倍，其實際濃度應該×N。

操作程序總結(jié)：
1.加樣品和標準品，37℃反應90分鐘。不洗。
2.加生物素標記抗體，37℃反應60分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌3次。
3.加ABC，37℃反應30分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌5次。
4.TMB37℃反應15-20分鐘。
5.加入TMB終止液，讀數(shù)。

參考標準曲線數(shù)據(jù)：(取自某一批次質(zhì)檢數(shù)據(jù)，僅供參考，用戶需要自己建立標準曲線)

人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子GMCSF試劑盒原理:

問：同一樣品多次活性測試結(jié)果差異大怎么解決？

答：樣本保存不當，會導致多次實驗結(jié)果偏差較大，樣本應盡量減少反復凍融，如需多次檢測，需在取樣后分裝保存。

問：檢測樣本是細胞培養(yǎng)上清，那么細胞數(shù)目對炎癥因子的濃度有影響嗎？

答：有影響，所以不同樣本可以比較的前提條件是培養(yǎng)細胞數(shù)水平接近一致。

問：請問標曲是每次都要做嗎？

答：是的，每次實驗，孵育時間，洗板次數(shù)等等條件均不一樣，不同實驗的標曲不能混用，做一次實驗需要做一次標準曲線，并且用當次，同一塊板上的標準曲線結(jié)果去計算板內(nèi)樣品的濃度，才能得到準確的結(jié)果。

問：做預實驗時每種要做幾個復孔呀？

答：預實驗視情況而定，如果整個板子孔數(shù)較為充足，建議兩個復孔，如不充足，單孔也可以。要盡量保證實驗過程中加樣準確。

問：血清樣本少量溶血，顏色稍深，對結(jié)有影響嗎？

答：會有影響，建議取樣時需注意，避免溶血、脂血等樣本。如樣本條件受限，建議用樣本稀釋液適當稀釋，減少基質(zhì)效應影響。

問：試劑盒有推薦稀釋濃度還需要自己測嗎？

答：試劑盒一般會給出不同樣品的推薦稀釋比例，但是為大致范圍，還是根據(jù)自己的樣本情況，設計預實驗測量計算。

問：加完終止液之后測的幾次數(shù)據(jù)差別也蠻大？

答：加完終止液后，顯色反應也不是永遠停止，形成的黃色顏色會隨著時間延長繼續(xù)加深，建議在15 min內(nèi)讀數(shù)。

問：副孔差別比較大，是沒洗干凈嗎？

答：復孔值差異較大，主要原因應考慮加樣是否準確，洗板過程中是否有殘留以及是否有交叉污染。

問：配好的抗體沒用完如何保存，可保存多久？預實驗用了一個試劑盒里面的部分板子和試劑，剩下的板子和試劑還能繼續(xù)用于正式實驗嗎？

答：一般來講，配好的母液，可以在四度保存，多一個月左右。剩下的板子和試劑是可以繼續(xù)用于正式實驗的，間隔時間不要太長，一個月之內(nèi)均可，需注意試劑避免污染，板子保持干燥。

問：后顯示的OD值在多少之間屬于可用值，有要求嗎？

答：有的，建議標準曲線高濃度點的OD值在2.0左右較好，也可參考說明書標曲的數(shù)據(jù)。

問：樣本總是在標準曲線之外，稀釋100倍也是，怎么辦？

答：在設置稀釋倍數(shù)之前，需要參考相關(guān)文獻，對于一些表達*的蛋白，確實會出現(xiàn)這種情況，建議繼續(xù)提高稀釋比例。

問：試劑盒推薦用450和540nm雙波長檢測，但條件有限可否換成450和620的雙波長？如何使用校準波長？還有，用空白孔校準可以么？

答：可以的，TMB底物顯色后，吸光峰值在450nm，另外的校準波長是防止氣泡等雜質(zhì)造成的干擾設置，避開450左右50nm以上即可。兩次讀取的OD值，用OD450 - OD校準波長即可。盡量還是建議有條件的選用雙波長校準的方法，因為避免了不同孔的讀數(shù)影響，防止出現(xiàn)空白孔污染，導致讀數(shù)較高，無法校準的情況。

問：ELISA可以檢測胞內(nèi)蛋白么？

答：可以的，選用支持組織勻漿的ELISA試劑盒即可，將組織樣品或細胞樣品進行裂解，提取胞內(nèi)蛋白后進行蛋白定量，保證每孔上樣總蛋白量一致即可。

問：ELISA試劑盒顯色液是雙組份的，有些其他品牌的是單組分的，使用單組分的有影響么？

答：HRP酶標二抗的ELISA試劑盒，顯色底物一般為TMB，TMB不穩(wěn)定，曝光或污染氧化后會出現(xiàn)顯色反應，導致實驗背景升高，或無法使用，所以愛必信的ELISA試劑盒將顯色液調(diào)整為雙組份，方便穩(wěn)定保存，僅在使用前混合，避免了TMB的不穩(wěn)定影響實驗結(jié)果。如您選用的試劑盒為單組分顯色液，在使用前檢測是否為無色透明，如果是正常的，對結(jié)果也沒有影響，可以放心使用。

問：整個過程需要避光嗎？避光需要避到什么程度呢？

答：ELISA實驗中，在酶標抗體孵育，以及顯色底物孵育這兩步建議避光，其他步驟無需避光。避光可采用錫紙包裹，或?qū)⒄麄€ELISA板子放入暗盒或抽屜等無光處即可。

問：標準曲線在推薦的濃度下，r值為0.9，做了多次都是這樣，怎么辦？

答：要仔細核對產(chǎn)品說明書，看是否用了推薦的擬合方法，如愛必信的ELISA試劑盒，需要使用四參數(shù)擬合方式進行擬合，用錯擬合方式，會導致r方值較低；如擬合方式無誤，需檢查是否有個別標曲孔數(shù)值異常，排查實驗中是否出現(xiàn)污染或倍比稀釋時出現(xiàn)失誤。

問：封板膜什么時候用？每次加液后都要換嗎？

答：封板膜在孵育樣品、檢測抗體以及HRP酶標抗體是，都要蓋好封板膜，減少揮發(fā)及污染幾率。每次使用后要更換新的封板膜。

問：手動洗板過程中，拍過抗體或抗原的濾紙需要扔嗎？

答：是需要更換的，防止造成交叉污染，影響實驗結(jié)果的準確性。

問：有的wash buffer析出結(jié)晶后在37℃也不溶解，怎么辦？

答：可提高至55度，并多次搖晃。溶解后按比例稀釋即可使用。

問：測得的值都低于標準曲線的低值，是什么原因，應該怎么解決？

答：原因較多，首先是檢查樣品是否稀釋倍數(shù)過高，降低稀釋比，直至直接加樣本原液，如還檢測不出，需排查原因，建議在實驗組別設置中添加陽性對照孔，用明確表達的樣品作為陽性對照，如果標準曲線及陽性樣品均可測得正常的表達濃度，則表明實驗成功，其余待測樣品表達含量低于檢測下限，按照0計算即可。這種情況尤其對于炎癥因子較為常見，在健康樣本中，表達含量極低。

問：因為檢測限的原因，同一塊ELISA板子，部分樣本稀釋，部分樣本1:10稀釋，部分1:20稀釋，這樣設置可行嗎？結(jié)果可以比較嗎？

答：可以比較，不同稀釋比例，是因為不同樣本間的表達差異較大，只要保證稀釋后的檢測樣品測量值準確，還原回稀釋倍數(shù)后的濃度是可信的。可以用來比較不同樣本的原始濃度差。

問：試劑盒里面有捕獲抗體么？

答：即用型ELISA試劑盒中，捕獲抗體已經(jīng)預包被至試劑盒中的ELISA板上，沒有單獨的捕獲抗體提供，直接使用ELISA板孵育稀釋后的樣本及標準品即可。

問：ELISA實驗中，檢測計算抗原的濃度，臨界值怎么確定？

答：根據(jù)曲線測定的濃度，建議落在標準曲線的中間位置較好，極限不要超過標準曲線的上下限，如果超出較多，會影響計算結(jié)果準確性，建議調(diào)整稀釋比例。

問：In vivo周期長的話，不太好做預實驗，怎么辦？

答：In vivo造模取樣后，可將樣品分裝，取一部分樣品做ELISA預實驗，剩余樣品再進行正式實驗；如多批次實驗，操作較為一致，后續(xù)可取消預實驗，根據(jù)前期結(jié)果進行ELISA實驗濃度設置。

問：做實驗前怎么知道待測血清中炎癥因子的范圍呢？多大是高多小是低？

答：需要根據(jù)文獻推測，一般在健康人樣本中，炎癥因子表達很低，接近ELISA檢測下限，樣品無需稀釋或1:1稀釋即可，如已知為炎癥疾病或造模樣本，可參考文獻，在預實驗中設置1:10-100（或更高）的稀釋比例，預實驗檢測后確定佳濃度進行正式實驗。

問：ELISA實驗中的洗板步驟如果沒有洗板機，需要如何操作？

答：實驗室ELISA實驗做的較多，還是建議使用洗板機洗板，效果更好，也更方便控制。如果沒有洗板機，在洗板過程中，需要注意洗板液添加后不要從孔中溢出，在加洗板液后，靜置1-2min，甩干液體后，在吸水紙上大力拍干；重復三次。

問：ELISA實驗中，酶標抗體識別的是哪個抗體？

答：在雙抗夾心法ELISA中，酶標抗體識別的是檢測抗體，對檢測抗體進行識別和酶標記。

問：捕獲抗體如何包被在96孔板上？

答：如果選用的是即用型ELISA試劑盒，無需進行抗體包被；如果是非即用型的ELISA試劑盒，首先，要選擇ELIS*別的板子，材質(zhì)應為聚苯乙烯；然后用抗體包被液稀釋（pH9.6的碳酸鹽緩沖液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl）成工作濃度，然后每孔加100 μl稀釋后的捕獲抗體，室溫或4℃過夜包被，然后進行洗板和封閉之后即可使用，如需長期保存，需要真空凍干后保存

問：ELISA實驗中的捕獲抗體和檢測抗體是同一個抗體么？

答：不是的，在雙抗夾心法ELISA實驗中，會同時用到捕獲抗體和檢測抗體，這兩個抗體是針對同一抗原蛋白的不同抗原位點的兩種抗體，這樣才可以同時結(jié)合抗原分子。

問： ELISA可以測DNA的表觀么？

答：不可以，ELISA是利用免疫學原理，定量檢測蛋白質(zhì)表達的技術(shù)。測DNA表觀遺傳學，主要是檢測DNA甲基化，可以選用ChIP技術(shù)。