【技術分享】細胞活性檢測方法大全

時間：2022/3/9閱讀：2640

細胞的活性鑒定在生物學和醫(yī)學上具有很重要的意義。它是體外細胞培養(yǎng)技術中常用的一個檢測指標。不同的細胞活性鑒定方法有各自不同具體的反應機理，但無論采用哪種方法，都利用了死細胞和活細胞在生理機能和性質上的差異。常用的方法有直接染色法，克隆形成試驗，比色法等。

下面我們就簡單的了解一下常用的細胞活性檢測方法的原理，特點，以及各自的優(yōu)缺點。

一、染色計數法

化學染色法
染色計數法是細胞培養(yǎng)中檢查細胞死活zui常用的方法,直接利用死細胞和活細胞對染料的不同親和力,檢查細胞活性,能在光學顯微鏡下觀察到染色結果.可分為兩類:死細胞著色法和活細胞著色法.使死細胞著色的常用染料有臺盼藍,苯胺黑,伊紅Y.能使活細胞著色的常用染料有結晶紫,亞甲基藍,甲苯胺藍等.其中zui常用的是臺盼藍染色法….細胞損傷或死亡時,臺盼藍可穿透變性的細胞膜,與解體的DNA結合,使其著色,而活細胞能阻止染料進入細胞內,故可以鑒別死細胞與活細胞.通過細胞計數可得出細胞的存活率.
優(yōu)點：方便實用，價格低廉，操作簡單
缺點：時間不宜過長,否則部分活細胞也會著色,會干擾計數.而且,細胞沒有經過固定,形態(tài)不清晰.
熒光染色法
一些熒光染料對死細胞和活細胞也有不同的作用效果,利用熒光顯微鏡檢測細胞活性.如碘化丙錠。(PI),被活細胞排斥但能穿透正在死亡或已經死亡細胞的細胞膜,因此活細胞不被染料染上色,只有死細胞或是凋亡細胞才能染上紅.色.葉啶橙(AO)能透過質膜完整的細胞,嵌入細胞核DNA,使之發(fā)出明亮的綠色熒光.溴化乙錠(EB)僅能透過胞膜受損的細胞,嵌入核DNA,發(fā)橘紅色熒光.也可應用AO—EB雙染法鑒定細胞死活.
優(yōu)點：這種檢測方法相比傳統(tǒng)的染料,具有靈敏度高,操作簡便,結果容易分辨等特點,而且利用雙染法還可以分辨活細胞,凋亡早期細胞,凋亡晚期細胞,死亡細胞，在細胞凋亡的檢測上有很廣泛的應用。
缺點：要求特殊的儀器進行檢測,如熒光顯微鏡,激光掃描共聚焦顯微鏡或流式細胞儀.而且通常熒光染料具有毒性,操作作時需要帶手套.

二、克隆形成試驗

克隆形成試驗是測定單個細胞增值能力的有效方法之一,其基本原理是單個細胞在體外持續(xù)分裂增殖6 次以上,其后代所組成的細胞群體,稱為克隆或集落.一般情況,每個克降可含50個以上的細胞,大小在0.3~~I.0mm之間.通過計數克隆形成率,可對單個細胞的增值潛力做定量分析.常見的方法有平板克隆形成試驗,軟瓊脂形成試驗等.這種方法常見于抗腫瘤藥物敏感性試驗,腫瘤放射生物學試驗等.

優(yōu)點：在低劑量輻射下,克隆形成試驗比 MTT和SRB法的敏感性更強.

缺點：較為繁瑣并耗l時,不適合同時監(jiān)測大量樣品,而且在手動計數過程中帶有非常大的不確定性,特別是當形成的細胞克降大小差異較大時,很難得到更有效,精確的數據.

三、比色法

比色法便是利用活細胞還原力，尤其是線粒體中脫氫酶，將底物還原后檢測吸光值的改變來衡量活細胞還原力。在對細胞還原力的檢測中，培養(yǎng)液中若存在還原酶類，例如谷胱干肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST），可能會使測定結果偏離,真實水平偏高。目前應用的底物以刃天青鹽類和四唑鹽類為主，在四唑鹽類的底物中尤其以靈敏度高、重復性好、毒性極低的CCK-8很受歡迎。下面跟小編一起比較一下這兩類底物的優(yōu)缺點吧！

1. 刃天青（resazurin）

刃天青溶液呈藍色，通常用作酸堿指示劑（pH3.8橙～6.5深紫）和氧化還原指示劑。在進行細胞活性檢測時，刃天青可滲入細胞并被活細胞不可逆地還原為粉紅色，同時有紅色熒光的試鹵靈（resorufin）出現。試鹵靈的吸光值或熒光強度與細胞數量、還原能力呈正相關，因此可通過任一參數來評估細胞活性。

2.四唑鹽（tetrazolium salts）

四唑鹽（表1）是一種人工合成的雜環(huán)化合物，它可被活細胞還原生成甲臜（Formazan），不同的四唑鹽衍生物作底物會得到不同顏色的甲臜，與試鹵靈一樣，甲臜的吸光值大小與細胞數量、代謝活性呈正相關，并以此作為細胞活性強弱的指標（圖1）。