相信大家作剛開(kāi)始做為實(shí)驗(yàn)小白，剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，學(xué)的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)就是提質(zhì)粒了。當(dāng)時(shí)剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，看著師兄做實(shí)驗(yàn)的樣子好酷呀！

跟在師兄后面，認(rèn)真的對(duì)每一步的步驟都做好筆記，后來(lái)才發(fā)現(xiàn)你只不過(guò)是做了一份手抄版的說(shuō)明書(shū)。

（1）快速純化質(zhì)粒；

（2）用于測(cè)序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

（1）細(xì)菌的培養(yǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增

（2）細(xì)菌菌體的裂解

（3）質(zhì)粒DNA的純化

1. 將鑒定測(cè)序正確的克隆菌液涂在LB固體平板。（一種培養(yǎng)基，使質(zhì)粒擴(kuò)增）。

2. 置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12-17h，待長(zhǎng)出菌落。

3. 滅菌15ml離心管內(nèi)加入5ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，編號(hào)標(biāo)記。

4. 挑取單克隆菌團(tuán)放置液體培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基放置1個(gè)菌落。

5. 37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

1.離心擴(kuò)增好的菌液，按說(shuō)明書(shū)將菌液重懸，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中。

2.用質(zhì)粒小量抽提試劑盒，按說(shuō)明書(shū)要求提取質(zhì)粒。

3.細(xì)菌高速離心1min,*去除上清。

4.加入250ulRB溶液，振蕩器充分懸浮細(xì)菌。

5.加入250ulLB溶液。立即上下顛倒10次，使細(xì)菌裂解，室溫，放置2min。

6.加入250ulNB溶液。立即上下顛倒10次，使之充分中和，室溫，放置2min。

7.室溫，1500rpm，高速離心15min。

8、將吸附柱放入收集管內(nèi)，離心得到的上清轉(zhuǎn)移至吸附柱，室溫，15000rpm，高速離心30s。

9、棄廢液，將吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速離心30s。

10、重復(fù)上一操作。

11、將吸附柱放入干凈的1.5ml 離心管中，加30-50ul預(yù)熱的Elution Buffer，室溫，放置2min，高速離心1min。

12、樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)：1%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為2ul，紫外燈下觀察，最明亮的帶為超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取質(zhì)粒的純度。

1. 將之前提取好的質(zhì)粒放入1.5ml離心管中，加入1/10體積的3mol/L 無(wú)菌乙酸鈉溶液。

2. 加入2倍體積的無(wú)水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或過(guò)夜。

3. 4℃，高速離心機(jī)14000rpm，離心20min.

4. 棄去上清，70%乙醇洗2次。

5. 空氣干燥，可置超凈工作臺(tái)干燥。

6. 加200ul無(wú)菌水溶液干燥后所得沉淀，即為質(zhì)粒溶液。

7. 紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒濃度和產(chǎn)量。

測(cè)量OD260和OD280的值：質(zhì)粒DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數(shù)（μg/mL）。

質(zhì)粒DNA的提取方法主要有堿裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢x器設(shè)備擇取不同的實(shí)驗(yàn)方案。

此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。方法如下:

1.接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2ml LB培養(yǎng)基。

2.37°℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

3.取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。

4.加加o.1lm1溶液I(1%葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0,25mML Tris-HC1 pH8.0)充分混合。

5.加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1% SDS)，車(chē)輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。

6.加入0.15m1預(yù)冷溶液III(5 molLKAc, pH4.8),輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min 。

7.以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管

8.加入等體積的異戊醇，混勻后于0℃靜置10min。

9.再以10，000rpm離心20min，棄上清。

10.用70%乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。

11.待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE緩沖液中

1.將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppendorf管中，4C下12000g離心30秒。

2.棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。

3.將菌體沉淀懸浮于120m1 STET溶液中，渦旋混勻。

4.加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，渦旋振蕩3秒鐘。

5.將eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。

6.用微量離心機(jī)4C下12000g離心10分鐘。

7.用無(wú)菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。

8.取20ml進(jìn)行電泳檢查。

1.從瓊脂平板上挑取轉(zhuǎn)化菌陽(yáng)性克隆，接種到標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)液中(含有卡那霉素30 ug/mL)搖菌12 h;收集1.5 mL菌液，8000 g/min離心3 min，棄上清，沉淀加入200 _uL TE，充分混勻;加入400 uL酚氯仿(1 : 1體積）混合液，劇烈振動(dòng)10 s，混勻;12 000g/min離心5 min，1 mL胰島素注射針收集上清，盡量避免吸入蛋白沉淀層;上清經(jīng)國(guó)產(chǎn)0。22 um針式濾器過(guò)濾1次;向過(guò)濾上清液內(nèi)加入2倍體積無(wú)水乙醇，振蕩10 s,12 000 g/min離心5 min;沉淀溶于20uL的RTE溶液中，37°℃水浴。

2.按PstI內(nèi)切酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶切反應(yīng)(37°C，1h)。酶切產(chǎn)物10 uL,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

3.PCR引物根據(jù)參考文獻(xiàn)〔1〕設(shè)計(jì)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小為714 bp。

4.常規(guī)制備感受態(tài)菌E。coli DH5a，提取質(zhì)粒DNA常規(guī)轉(zhuǎn)化感受態(tài)，涂于含有卡那霉素(30 umL)LB培養(yǎng)平板中，37C培養(yǎng)，15 h后觀察篩選克隆情況。