細胞凍存與復蘇及細胞計數(shù)存活測試的操作方法與步驟

細胞冷凍與復蘇是細胞培養(yǎng)的常規(guī)工作，可以解決細胞因為連續(xù)繼代造成的退變或轉(zhuǎn)化。細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)以及細胞凍存和復蘇后都需要細胞計數(shù)。
一、細胞冷凍保存
1、材料：
生長良好之培養(yǎng)細胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO (Sigma D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene　5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計數(shù)盤與蓋玻片、等速降溫機(KRYO10SeriesII)
2、冷凍保存方法：
(1)傳統(tǒng)方法: 冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-80℃16～18小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。
-20℃不可超過1小時，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。
3、步驟：
(1)冷凍前24-48小時更換半量或全量培養(yǎng)基，使細胞處于指數(shù)生長期。
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制)：另取一離心管，加入培養(yǎng)基、血清，逐滴加入二甲基亞砜 (DMSO)至20%濃度，即制成雙倍的凍存液，置于室溫下待用。
(3)離心收集培養(yǎng)之細胞，用加血清的培養(yǎng)基重懸起細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。
(4)取與細胞懸液等量的凍存液，緩慢逐滴加入細胞懸液，并晃動試管，制成細胞凍存懸液(DMSOzui后濃度為5～10%)，使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1～2ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后，注明細胞名稱、代數(shù)、日期。然后進行凍存。
4、注意事項：
(1)欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài)，約為80～90%致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
(2)細胞在液氮中可長期凍存無*，而不會影響細胞活力;在-70度可保存數(shù)月。
(3)注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22micron　FGLP　flon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液，可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲，可降低細胞受損。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化，可換用10%甘油凍存。
(4)冷凍保存之細胞濃度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后。
③adherent tumor lines:5～7×106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
(5)冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。
(6)凍存可用10%～90%的血清，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細胞懸浮而少沉積(4度時)，復蘇存活率在80%～90%以上，對原代培養(yǎng)細胞，以90%血清凍存更為有效。
二、冷凍細胞活化
1、冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。
2、細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
3、材料
37℃恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器
4、步驟：
(1)操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
(2)自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。
(3)將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。
(4)取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。
(5)取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試。
(6)解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol)，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
(7)若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
三、細胞計數(shù)與存活測試
1、原理：
(1)計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。
(2)血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。
(3)存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計算細胞活率：活細胞數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%。計數(shù)應在臺盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時間延長，部分活細胞也開始攝取染料;因為臺盼蘭對蛋白質(zhì)有很強的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計數(shù)更為準確。
2、材料：
0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計數(shù)器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細胞稀釋液(4%乙酸溶液)。
3、步驟：
(1)取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
(2)取少許混合液(約15μl)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bluish)。
(3)計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，zui后乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
注：4大格細胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細胞數(shù)/ml;每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
計數(shù)板計數(shù)時，zui適濃度為5～10×105細胞/ml，此范圍外計數(shù)誤差偏大。高濃度細胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計數(shù)。
5、范例：
T75 monolayer culture制成10ml細胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之細胞數(shù)目。
活細胞數(shù)/方格：55，62，49，59;死細胞數(shù)/方格：5，3，4，6;細胞總數(shù)=243
平均細胞數(shù)/方格=60.75;稀釋倍數(shù)=2;
細胞數(shù)/ml：60.75×104×2(稀釋倍數(shù))=1.22×106;
細胞數(shù)/flask(10ml)：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%
在細胞復蘇過程中經(jīng)歷多次復蘇失敗，zui終在查閱了相關(guān)技術(shù)積累了足夠的復蘇技能后復蘇成功，上述是個人總結(jié)的細胞凍存復蘇及細胞計數(shù)的操作程序和注意事項，望能為各位同學提供些參考。