Aging-induced impaired endothelial wall shear stress mechanosensing causes arterial remodeling via JAM-A/F11R shedding by ADAM17

Keywords: Aging; Endothelium dysfunction; F11R; Junctional adhesion molecule-A; Mechano-transduction.

隨著年齡的增長(zhǎng)，心血管系統(tǒng)發(fā)生了重要變化，包括血管硬度升高和異常重塑。研究表明，與衰老相關(guān)的小阻力動(dòng)脈重塑可以獨(dú)立于全身血壓的變化而發(fā)生。研究已表明，小阻力動(dòng)脈會(huì)因血流的持久變化或血流停止而發(fā)生重塑。值得注意的是，在血管調(diào)節(jié)和信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用的不是血流速率，而是壁面剪切應(yīng)力（WSS），即由流動(dòng)血液在內(nèi)皮細(xì)胞表面的摩擦驅(qū)動(dòng)的切向力。WSS由血流速度、粘度和血管管腔直徑確定。在阻力動(dòng)脈中，WSS的時(shí)間增加會(huì)誘導(dǎo)血管舒張，從而有助于組織灌注的前饋調(diào)節(jié)。長(zhǎng)期的WSS可以直接影響微循環(huán)中的血管壁重塑和血管生長(zhǎng)。

假定的內(nèi)皮WSS機(jī)械感覺(jué)復(fù)合物由血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1（PECAM-1）、VE-鈣粘蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）和其他分子組成，主要定位于內(nèi)皮細(xì)胞連接處。連接粘附分子-A（JAM-A/F11R）是內(nèi)皮細(xì)胞連接復(fù)合物的組成部分，對(duì)于細(xì)胞的機(jī)械連接作用以及細(xì)胞間的信號(hào)傳遞具有重要作用。值得注意的是，研究表明，衰老會(huì)改變JAM-A/F11R的功能，由于其組織表達(dá)水平降低?；诖?，有研究報(bào)道了老年人和老年小鼠的脂肪組織動(dòng)脈中去整合素-金屬蛋白酶17（ADAM17），又稱(chēng)為T(mén)NF-α轉(zhuǎn)化酶（TACE），的活性增加，這有助于TNF介導(dǎo)的遠(yuǎn)端血管功能障礙。有趣的是，ADAM17介導(dǎo)其他幾種膜結(jié)合分子的蛋白水解脫落，包括JAM-A/F11R，且先前的一項(xiàng)體外研究表明，ADAM17的激活與內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-A/F11R的蛋白水解釋放有關(guān)。

基于上述基礎(chǔ)，美國(guó)喬治亞州奧古斯塔大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系、藥理學(xué)和毒理學(xué)系的課題組曾在一項(xiàng)研究中驗(yàn)證了與衰老相關(guān)的 ADAM17 激活和 JAM-A/F11R 脫落增加會(huì)損害內(nèi)皮細(xì)胞 WSS 機(jī)械感應(yīng)，從而導(dǎo)致小阻力動(dòng)脈的異常管腔狹窄重塑的特定假設(shè)。研究成果發(fā)表在GeroScience 期刊題為“Aging-induced impaired endothelial wall shear stress mechanosensing causes arterial remodeling via JAM-A/F11R shedding by ADAM17"。

首先，為了解決生物力學(xué)力是否與衰老相關(guān)的血管重塑有關(guān)，評(píng)估了WSS誘導(dǎo)的幼齡和老年小鼠的離體和加壓骨骼肌動(dòng)脈中的血管舒張作用。施加的壓力梯度在幼齡和老年小鼠的動(dòng)脈中誘導(dǎo)了相同水平的腔內(nèi)血流。然而，與幼齡小鼠（~ 10 dyne/cm2）相比，老年小鼠WSS誘導(dǎo)的血管舒張不僅程度降低，而且最大擴(kuò)張反應(yīng)需要更高的WSS水平（~ 25 dyne/cm2）。在任何給定的流速下，WSS在老年小鼠的動(dòng)脈中仍然顯著更高。此外，在20-100 mmHg的腔內(nèi)壓力范圍內(nèi)，從老年小鼠分離的小骨骼肌動(dòng)脈與幼鼠相比內(nèi)徑減小。與幼鼠相比，老年小鼠動(dòng)脈的壓力-壁厚度、壓力-壁厚度/管腔比和壓力-橫截面積關(guān)系增加。來(lái)自老年小鼠的組織學(xué)切片顯示股薄肌動(dòng)脈的中膜厚度增加。這些數(shù)據(jù)表明，WSS反應(yīng)受損與老年小鼠骨骼肌拮抗動(dòng)脈內(nèi)向肥厚性重塑（inward hypertrophic remodeling）有關(guān)。

此外，在幼齡和老年小鼠的骨骼肌動(dòng)脈壁（包括內(nèi)皮細(xì)胞）中檢測(cè)到ADAM17的表達(dá)（圖1 a）。與幼鼠相比，老年小鼠骨骼肌動(dòng)脈中ADAM17蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)（圖1 b）。內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá) JAM-A/F11R，一種 ADAM17 切割底物，其在兩種小鼠中的總蛋白表達(dá)水平?jīng)]有變化（圖1 a、b）。

此前，ADAM17激活已被證明可以通過(guò)調(diào)節(jié)切割改變JAM-A/F11R的亞細(xì)胞定位。為了確定 JAM-A/F11R 內(nèi)皮細(xì)胞分布的衰老相關(guān)變化，在兩種小鼠的主動(dòng)脈中進(jìn)行了面部免疫染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JAM-A/F11R在老年小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞中分布更廣泛，且這些小鼠的細(xì)胞連接邊界也不規(guī)則（圖1 c、d）。相對(duì)于VE-鈣粘蛋白，JAM-A / F11R的內(nèi)皮細(xì)胞連接定位水平在老年小鼠中顯著降低（圖1 e）。老年小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞核比年輕小鼠更短（圖1 f）。鑒于血流WSS導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞及其細(xì)胞核伸長(zhǎng)，該數(shù)據(jù)也表明老齡動(dòng)物中動(dòng)脈WSS誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生了改變。

此外，在加入PMA（一種ADAM17激活劑）或未加入的情況下，HUVECs暴露于WSS（8 dyne/cm2，48 小時(shí)），發(fā)現(xiàn)PMA降低了連接定位的JAM-A/F11R的表達(dá)，而沒(méi)有顯著改變細(xì)胞核長(zhǎng)寬比（圖1 i、j）。這些數(shù)據(jù)表明，ADAM17 減少老年小鼠內(nèi)皮細(xì)胞連接處定位的 JAM-A/F11R。

圖1     ADAM17表達(dá)的增加伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞連接處定位的JAM-A/F11R的減少。

接下來(lái)，為了具體評(píng)估 ADAM17 對(duì) WSS 反應(yīng)和隨后在體內(nèi)發(fā)生的動(dòng)脈重塑的影響，在骨骼肌動(dòng)脈管腔中構(gòu)建 ADAM17 過(guò)表達(dá)和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ADAM17在幼鼠動(dòng)脈中的過(guò)表達(dá)顯著降低了WSS誘導(dǎo)的擴(kuò)張程度。與衰老動(dòng)脈的反應(yīng)類(lèi)似，與對(duì)側(cè)對(duì)照動(dòng)脈或 eGFP 過(guò)表達(dá)的血管相比（~ 5-10 dyne/cm2），在 ADAM17 過(guò)表達(dá)的動(dòng)脈中，WSS 誘導(dǎo)的血管舒張僅在較高的 WSS 水平（~ 20 dyne/cm2）下達(dá)到最大值。此外，ADAM17過(guò)表達(dá)后WSS反應(yīng)受損伴有動(dòng)脈壁厚度增加和壁腔-管腔-壓力關(guān)系增加。這說(shuō)明，ADAM17 的體內(nèi)過(guò)表達(dá)會(huì)損害 WSS 反應(yīng)并誘導(dǎo)幼鼠動(dòng)脈中的血管重塑。

進(jìn)一步研究 ADAM17 損害內(nèi)皮細(xì)胞中 WSS 機(jī)械感應(yīng)的潛在機(jī)制，將HUVECs 在不同 WSS 水平（0-32 dyne/cm2）下進(jìn)行穩(wěn)定層流持續(xù)3 天。?內(nèi)皮細(xì)胞的排列方式是衡量其感知和響應(yīng)WSS能力的一個(gè)重要指標(biāo)。在WSS下，內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)長(zhǎng)的形態(tài)并與血流方向?qū)R，在 8 dyne/cm2 時(shí)達(dá)到與血流方向的最大對(duì)齊（即最小角度偏差）。因此，在重組ADAM17蛋白或轉(zhuǎn)染JAM-A/F11R靶向siRNA或?qū)φ誷iRNA的HUVECs中，測(cè)量了內(nèi)皮細(xì)胞排列（WSS，8 dyne/cm2，3天）。雖然 ADAM17 暴露或 JAM-A/F11R 耗竭的內(nèi)皮細(xì)胞顯示出細(xì)長(zhǎng)的形態(tài)，但與對(duì)照 siRNA 轉(zhuǎn)染的 HUVECs 相比，它們?cè)?3 天的培養(yǎng)期間未能在流動(dòng)方向上對(duì)齊（圖2）。這說(shuō)明，ADAM17 的激活或JAM-A/F11R 的 缺失會(huì)損害 WSS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞排列。

圖2    ADAM17激活或JAM-A/F11R缺失會(huì)損害WSS依賴(lài)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞的排列。

為了確定 JAM-A/F11R 是否是 ADAM17 的直接底物，實(shí)驗(yàn)生成了 ADAM17 抗切割的人 JAM-A/F11R。用野生型JAM-A（wtJAM-A）或mtJAM-A^V232Y 轉(zhuǎn)染HUVECs，在有或沒(méi)有重組 ADAM17 下經(jīng)受WSS（8 dyne/cm2）。結(jié)果注意到，表達(dá)mtJAM-A^V232Y的HUVECs條件培養(yǎng)基中含有的JAM-A/F11R水平明顯低于表達(dá)wtJAM-A的細(xì)胞。表達(dá)HUVECs的wtJAM-A和mtJAM-A^V232Y均呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的形態(tài)，并與流動(dòng)方向?qū)R。這些數(shù)據(jù)表明，突變的 JAM-A/F11R 不會(huì)改變正常的 WSS 響應(yīng)。

此外，表達(dá)wtJAM-A的細(xì)胞經(jīng)過(guò)重組ADAM17后會(huì)拉長(zhǎng)，但不能有效地定位于流動(dòng)方向。相比之下，即使在ADAM17存在的情況下，表達(dá)mtJAM-A^V232Y的HUVECs也被拉長(zhǎng)并對(duì)齊。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了 WSS 傳感機(jī)制中的一個(gè)特定缺陷，即野生型 JAM-A/F11R 表達(dá)細(xì)胞在 ADAM17 暴露后與流動(dòng)方向?qū)R，這被 ADAM17 抗切割的 mtJAM-A^V232Y挽救。

最后，確定了與衰老相關(guān)的 WSS 機(jī)械感知損傷和異常動(dòng)脈重塑是否可以逆轉(zhuǎn)。在受限動(dòng)脈內(nèi)遞送編碼ADAM17抗切割突變小鼠JAM-A/F11R的AAV2QuadYF載體2周后，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)骨骼肌阻力動(dòng)脈段表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的WSS誘導(dǎo)的擴(kuò)張，而內(nèi)皮依賴(lài)性激動(dòng)劑ACh- 和直接NO供體SNP- 誘導(dǎo)的反應(yīng)與老年小鼠的對(duì)側(cè)動(dòng)脈相似（圖3 a-c）。然而，與老年小鼠對(duì)側(cè)動(dòng)脈相比，mtJAM-A^V232Y過(guò)表達(dá)動(dòng)脈段的動(dòng)脈壁厚度、壁-管腔壓力關(guān)系以及動(dòng)脈內(nèi)管腔直徑-壓力關(guān)系均無(wú)明顯變化（圖3 d-f）。這些數(shù)據(jù)表明，在體內(nèi)，過(guò)表達(dá)ADAM17抗切割突變小鼠JAM-A^V232Y可改善WSS反應(yīng)，但不能逆轉(zhuǎn)老年小鼠的異常重塑。

圖3     ADAM17抗切割小鼠JAM-A^V232Y的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了WSS誘導(dǎo)的老年小鼠血管舒張。

（g）示意圖闡述了所提出的新機(jī)制，其中 WSS（t）的機(jī)械感應(yīng)降低，而不是流量大?。≦），決定了衰老過(guò)程中血管舒張降低和小阻力動(dòng)脈的異常重塑。在正常WSS感應(yīng)的年輕小鼠（左）小阻力動(dòng)脈中，JAM-A / F11R參與WSS機(jī)械感應(yīng)和NO產(chǎn)生，誘導(dǎo)血管舒張并對(duì)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)揮抗增殖作用。在老年小鼠的動(dòng)脈（右）中，ADAM17 介導(dǎo)的 JAM-A/F11R 切割的增強(qiáng)和再分配是 WSS 感應(yīng)受損的基礎(chǔ)，這導(dǎo)致血管舒張減少并促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，從而引起向內(nèi)肥厚性動(dòng)脈重塑，與血流速度無(wú)關(guān)，即使在 WSS 水平升高的情況下也是如此。

該研究旨在驗(yàn)證 WSS 機(jī)械傳感中與衰老相關(guān)的損傷是阻力動(dòng)脈異常重塑的主要原因的假設(shè)。研究結(jié)果表明，在衰老過(guò)程中，上調(diào)的 ADAM17 表達(dá)會(huì)損害血管內(nèi)皮 WSS 機(jī)械感知過(guò)程，導(dǎo)致骨骼肌阻力動(dòng)脈的管腔狹窄和肥厚性重塑。體內(nèi)和體外證據(jù)揭示，通過(guò)內(nèi)皮 JAM-A/F11R 的過(guò)度切割，ADAM17 的血管表達(dá)增加與 WSS 誘導(dǎo)的血管舒張受損和 WSS 依賴(lài)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞排列減少有關(guān)（圖3 g）?？傊?，研究結(jié)論證明，與衰老相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞 WSS 機(jī)械感應(yīng)降低以及隨后發(fā)生的異常動(dòng)脈重塑在機(jī)制上與 ADAM17 介導(dǎo)的 JAM-A/F11R的過(guò)度切割增加有關(guān)，JAM-A/F11R是內(nèi)皮細(xì)胞WSS機(jī)械感知的新成員。

參考文獻(xiàn)：Tian Y, Fopiano KA, Buncha V, Lang L, Rudic RD, Filosa JA, Dou H, Bagi Z. Aging-induced impaired endothelial wall shear stress mechanosensing causes arterial remodeling via JAM-A/F11R shedding by ADAM17. Geroscience. 2022 Feb;44(1):349-369. doi: 10.1007/s11357-021-00476-1. Epub 2021 Oct 30. PMID: 34718985; PMCID: PMC8810930.

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