Paracrine- and cell-contact-mediated immunomodulatory effects of human periodontal ligament-derived mesenchymal stromal cells on CD4+ T lymphocytes

Keywords: CD4+ T lymphocytes; Co-culture; Human periodontal ligament-derived mesenchymal stromal cells; IL-1β; Immunomodulation; TNF-α.

從牙周膜分離的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（hPDL-MSCs）具有很高的治療潛力，這可能是由于它們的免疫調(diào)節(jié)特性。兩組不同的機制主要負(fù)責(zé)這些免疫調(diào)節(jié)能力：（1）可溶性免疫介質(zhì)和酶的分泌，包括IDO-1、PGE2和TSG-6，它們以旁分泌方式調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞；（2）和細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸機制，通過表達(dá)膜結(jié)合免疫介質(zhì)，包括PD-L1和 PD-L2。這些免疫調(diào)節(jié)機制在穩(wěn)態(tài)條件下通常較低，但在炎癥環(huán)境中會通過各種促炎細(xì)胞因子，包括IL-1β 和TNF-α 得到增強。由于免疫細(xì)胞是這些促炎細(xì)胞因子的主要來源，這導(dǎo)致 hPDL-MSCs 和免疫細(xì)胞之間存在緊密的雙向相互作用。

大多數(shù)關(guān)于這種相互關(guān)系的知識都來自體外研究，主要使用兩種不同的模型，即直接共培養(yǎng)模型和間接共培養(yǎng)模型，將 hPDL-MSCs 與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)。MSCs 與 T 淋巴細(xì)胞的相互作用是研究最多的免疫調(diào)節(jié)作用之一。大量研究已表明，hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，以及觸發(fā)和抑制調(diào)節(jié)性 CD4+ T 淋巴細(xì)胞（Tregs）和 CD4+ Th17 淋巴細(xì)胞分化的能力。然而，目前還沒有研究直接比較 hPDL-MSCs 和 CD4+ T 淋巴細(xì)胞相互作用背景下的共培養(yǎng)模式。

最近，維也納醫(yī)科大學(xué)牙學(xué)院牙周病臨床和牙周科研中心課題組的一項體外研究旨在不同細(xì)胞因子環(huán)境中使用直接和間接共培養(yǎng)模型比較 hPDL-MSCs 和 CD4+ T 淋巴細(xì)胞之間的雙向相互作用。研究結(jié)果顯示，共培養(yǎng)模型不同程度地影響 hPDL-MSCs 和 CD4+ T 淋巴細(xì)胞之間的相互作用，表明旁分泌和直接細(xì)胞間免疫調(diào)節(jié)機制都有助于觀察到 hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性。這似乎源于 hPDL-MSCs 中免疫介質(zhì)表達(dá)的可變性，具體取決于共培養(yǎng)模型和當(dāng)前的細(xì)胞因子類型。研究成果發(fā)表于 Stem Cell Research & Therapy 期刊題為“Paracrine- and cell-contact-mediated immunomodulatory effects of human periodontal ligament-derived mesenchymal stromal cells on CD4+ T lymphocytes"。

首先，比較了三種不同體外共培養(yǎng)模型（圖1 A）下hPDL-MSCs對CD4+ T淋巴細(xì)胞增殖（圖1 B、D、E）和活力（圖1 C）的影響，發(fā)現(xiàn)hPDL-MSCs 在所有三種體外共培養(yǎng)模型中均顯著降低 CD4+ T 淋巴細(xì)胞增殖（圖1 B）。在無插入物的間接和直接共培養(yǎng)中，分裂的 CD4+ T 淋巴細(xì)胞減少（圖1 D、E）。這些基于 hPDL-MSCs 的抑制作用在有或沒有插入物的直接體外共培養(yǎng)模型中明顯強于間接共培養(yǎng)模型（圖1  B）。此外，間接共培養(yǎng)的 hPDL-MSCs 顯示出抗細(xì)胞死亡作用，而沒有插入物的直接共培養(yǎng)可導(dǎo)致死亡 CD4+ T 淋巴細(xì)胞的顯著增加（圖1 C）。這些數(shù)據(jù)表明，hPDL-MSCs 抑制 CD4+ T 淋巴細(xì)胞的能力取決于所使用的共培養(yǎng)模型。

此外，對CD4+ T 淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生影響的觀察發(fā)現(xiàn)，在間接共培養(yǎng)模型中，hPDL-MSCs 顯著降低了 TNF-α、IL-10、IL-22、IL-5、IL-13 和 IL-9 的水平；在插入物的直接模型中，TNF-α 和 IFN-γ 被 hPDL-MSCs顯著降低，但與上述程度不同；IL-4 水平在兩種帶有插入物的共培養(yǎng)模型中均顯著增加，并在直接共培養(yǎng)模型中明顯更高；無插入物的直接共培養(yǎng)導(dǎo)致 TNF-α 顯著降低；相比之下，IL-10、IL-17A、IL-17F 和 IL-4 水平顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明，hPDL-MSCs 影響 CD4+ T 淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力也取決于體外共培養(yǎng)模型。

圖1    hPDL-MSCs抑制CD4+ T淋巴細(xì)胞的能力取決于共培養(yǎng)模型。

實驗還研究了不同體外共培養(yǎng)模型下白細(xì)胞介素IL-1β 觸發(fā)的 hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細(xì)胞增殖和活力的影響（圖2 A-J）。IL-1β的存在顯著增強了hPDL-MSCs對PHA- 激活的CD4+ T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用（圖2 A、B）。在 IL-1β 存在下，無插入物的直接共培養(yǎng)顯示 hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細(xì)胞增殖沒有明顯影響，然而，在無插入物的直接共培養(yǎng)中，IL-1β 處理的hPDL-MSCs顯著抵消了hPDL-MSCs介導(dǎo)的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)效應(yīng)（圖2 C、D）。這些數(shù)據(jù)表明，IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 影響 CD4+ T 淋巴細(xì)胞增殖和活力的能力取決于所使用的共培養(yǎng)模型。

此外，帶有插入物的間接和直接共培養(yǎng)模型中，IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌譜產(chǎn)生相似的影響：TNF-α、IL-10、IL-5、IL-13和 IL-9 顯著降低，而 IL-17A 和 IL-17F 顯著上調(diào)；IL-22 和 IL-4 在帶有插入物的間接和直接共培養(yǎng)模型中分別上調(diào)和下調(diào)，而 IFN-γ 在兩種共培養(yǎng)模型中均無顯著變化。相比之下，CD4+ T 淋巴細(xì)胞與 IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 直接共培養(yǎng)顯著觸發(fā)了所有研究的細(xì)胞因子水平的升高，除了IL-13 。這些數(shù)據(jù)表明，IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 影響 CD4+ T 淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力取決于體外共培養(yǎng)模型。

同樣，對于腫瘤壞死因子 TNF α觸發(fā)的 hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細(xì)胞增殖和活力的影響，數(shù)據(jù)也表明，TNF α處理的 hPDL-MSCs 影響 CD4+ T 淋巴細(xì)胞增殖和活力的能力以及改變CD4+ T淋巴細(xì)胞生成細(xì)胞因子的能力均取決于共培養(yǎng)模型。

圖2   IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 影響 CD4+ T 淋巴細(xì)胞增殖和活力的能力取決于所使用的共培養(yǎng)模型。

CD4+ T淋巴細(xì)胞與未處理或IL-1β 處理的hPDL-MSCs孵育5 天后，基于CFSE（A、B、E-J）和PI（C、D）染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測增殖和活力。

最后，實驗還研究了不同類型共培養(yǎng)實驗結(jié)束時 hPDL-MSCs 中免疫介質(zhì)基因表達(dá)的水平。與單培養(yǎng)相比，無論使用何種體外共培養(yǎng)模型，hPDL-MSCs 中所有研究的免疫介質(zhì)的基因表達(dá)水平都顯著增加（圖3 A-E），但無插入物的直接共培養(yǎng)中的 TSG-6 除外（圖3 C）。IDO-1（圖3 A）、TSG-6（圖3 C）和 CD274 （圖3 E）的水平在兩種直接共培養(yǎng)模型中降低。此外，PTGS-2 基因表達(dá)（圖3 B）在有插入物的直接共培養(yǎng)模型中顯著降低，相比之下，無插入物的直接共培養(yǎng)模型導(dǎo)致 PTGS-2 水平顯著增加。CD273 在各種體外共培養(yǎng)模型之間未觀察到差異（圖3 D）。這些數(shù)據(jù)表明，共培養(yǎng)模型的類型會影響 hPDL-MSCs 中免疫介質(zhì)基因表達(dá)。

此外，當(dāng)外源性 IL-1β 存在下，其對可溶性免疫介質(zhì)（IDO-1、PTGS-2、TSG-6）的基因表達(dá)水平的影響與共培養(yǎng)模型無關(guān)，但IL-1β 在間接與直接共培養(yǎng)中分別導(dǎo)致 CD273 的增加和減少。IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 與 CD4+ T 淋巴細(xì)胞直接共培養(yǎng)，在有和沒有插入物時，CD274 表達(dá)分別降低和增加，在間接共培養(yǎng)模型中未觀察到對 CD274 基因表達(dá)的影響。盡管這些數(shù)據(jù)表明了一些趨勢，但未觀察到膜結(jié)合免疫介質(zhì)基因表達(dá)水平的顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明，在外源性 IL-1β 存在下，體外共培養(yǎng)模型類型對hPDL-MSCs中膜結(jié)合免疫介質(zhì)（而非可溶性免疫介質(zhì)）的影響不同。

同樣，在 TNF-α 處理的 hPDL-MSCs 中，體外共培養(yǎng)模型類型對hPDL-MSCs中可溶性和膜結(jié)合免疫介質(zhì)的基因表達(dá)也均有不同的影響。

圖3     免疫介質(zhì)基因在hPDL-MSCs中的表達(dá)隨共培養(yǎng)模式的不同而改變。

總之，該研究表明共培養(yǎng)模型對 CD4+ T 淋巴細(xì)胞增殖、活力和細(xì)胞因子分泌等結(jié)果有顯著影響。在未處理和細(xì)胞因子處理的hPDL-MSCs中觀察到這些不同的效應(yīng)，可能是由不同共培養(yǎng)的hPDL-MSCs的免疫調(diào)節(jié)機制的可變性引起的?？偠灾?，這些差異可能源于共培養(yǎng)模型允許 hPDL-MSCs 和 CD4+ T 淋巴細(xì)胞之間發(fā)生不同的雙向相互作用（旁分泌+ 直接細(xì)胞間接觸或僅旁分泌）的事實。盡管直接共培養(yǎng)模型zuishihe模擬體內(nèi)情況，但間接共培養(yǎng)模型可以區(qū)分旁分泌和直接細(xì)胞間接觸免疫調(diào)節(jié)機制。因此，并行使用不同的共培養(yǎng)模型并直接比較結(jié)果將提供有關(guān)所涉及的免疫調(diào)節(jié)機制的信息，這將成為未來良好的科學(xué)實踐。

參考文獻：Behm C, Mi?ek O, Rausch-Fan X, Moritz A, Andrukhov O. Paracrine- and cell-contact-mediated immunomodulatory effects of human periodontal ligament-derived mesenchymal stromal cells on CD4+ T lymphocytes. Stem Cell Res Ther. 2024 May 31;15(1):154. doi: 10.1186/s13287-024-03759-4. PMID: 38816862; PMCID: PMC11141051.

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