Fluid shear stress enhances natural killer cell's cytotoxicity toward circulating tumor cells through NKG2D-mediated mechanosensing

Topics：Mechanical stress, Cytotoxicity, Degranulation, Immune response, Biomechanics, Cancer treatment, Cell mechanics

腫瘤轉(zhuǎn)移的連續(xù)步驟包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落、侵入周圍組織、在血管系統(tǒng)中內(nèi)滲和存活，以及外滲到遠(yuǎn)端部位并產(chǎn)生繼發(fā)性腫瘤。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是從原發(fā)腫瘤中脫落并進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞，CTCs會經(jīng)歷多種環(huán)境壓力，例如失巢凋亡、缺氧、剪切應(yīng)力、氧化應(yīng)激和免疫監(jiān)視。臨床研究報道，血液中 CTCs 的含量與癌癥患者的生存率高度相關(guān)。

免疫系統(tǒng)在腫瘤轉(zhuǎn)移的每一步都起著清除腫瘤細(xì)胞的重要作用。由于 CTCs 在血液中的半衰期較短（1-2.4 小時），因此通過免疫監(jiān)測有效殺死這些腫瘤細(xì)胞需要直接快速的識別和細(xì)胞毒性。自然殺傷細(xì)胞（NK）細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是 CTCs 的主要消除劑，可以通過一系列生殖性編碼的激活和抑制受體快速識別和殺死腫瘤細(xì)胞。

NK細(xì)胞表面的 NKG2D是一種重要的免疫激活型受體，它能夠識別多種配體分子，這些配體分子在免疫系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色。以往研究揭示了生物機(jī)械力如何通過選擇性機(jī)械調(diào)節(jié)配體的構(gòu)象變化，從而賦予NKG2D識別不同配體的能力，這表明 NKG2D 可能是一種潛在的機(jī)械傳感器。

在血管系統(tǒng)中，CTCs 同時暴露于 NK 細(xì)胞和流體剪切力（FSS）。然而，它們對 CTCs 存活的協(xié)同作用仍不清楚，特別是FSS 是否能影響 NK 細(xì)胞對 CTCs 的細(xì)胞毒性。鑒于此，香港理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的研究團(tuán)隊調(diào)查了 FSS 下 NK 細(xì)胞對 CTCs 細(xì)胞毒性的影響，剖析了剪切依賴性細(xì)胞毒性的潛在機(jī)制，包括 NK 分泌的細(xì)胞因子和顆粒酶B，還測試了 NKG2D 響應(yīng) FSS 的機(jī)械敏感性。研究成果發(fā)表于 APL Bioengineering 期刊題為“Fluid shear stress enhances natural killer cell's cytotoxicity toward circulating tumor cells through NKG2D-mediated mechanosensing"。

首先，為了研究 FSS 對 NK 細(xì)胞毒性的影響，使用懸浮乳腺癌細(xì)胞模擬CTCs，將其暴露于FSS（1和5 dyn/cm2）下。無論是否與NK細(xì)胞共培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞都表現(xiàn)出剪切依賴性死亡反應(yīng)。重要的是，NK 細(xì)胞和 FSS 下腫瘤細(xì)胞的裂解率遠(yuǎn)高于 NK 細(xì)胞或 FSS 誘導(dǎo)的死亡，特別是在 5 dyn/cm2 下。這表明 FSS 和 NK 細(xì)胞之間存在相互作用。同樣，在腫瘤細(xì)胞中觀察到剪切依賴性 caspase-3 激活和 caspase 活性增加，這可能部分解釋了剪切依賴性裂解反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)SS 可以促進(jìn) NK 細(xì)胞對 CTCs 的細(xì)胞毒性。

NK 細(xì)胞殺死 CTCs 的主要方式是與靶細(xì)胞作用形成偶聯(lián)物，通過免疫突觸釋放穿孔素在細(xì)胞膜上形成跨膜通道，并遞送主要效應(yīng)酶顆粒酶B。為了闡明 FSS 如何增強(qiáng) NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，測試了 FSS 對偶聯(lián)物形成的影響。結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞和 NK 細(xì)胞之間的偶聯(lián)物形成隨著 FSS 的增加而減少（圖1 a），這可能是由剪切介導(dǎo)的干擾引起的。然而，FSS越高，形成的偶聯(lián)物中凋亡細(xì)胞越多（圖1 b）。此外，CD107a（NK 細(xì)胞活性標(biāo)志物）的表達(dá)在 5 dyn/cm2 FSS 時顯著增加（圖1 c），表明剪切誘導(dǎo) NK 細(xì)胞的激活。

NK 細(xì)胞的微管組織中心（MTOC）負(fù)責(zé)裂解顆粒的定向遞送。MTOC 和突觸之間的距離隨著 FSS 的增加而減?。▓D1 d），表明 MTOC 極化依賴于剪切力。在 5 dyn/cm2 FSS 下，MTOC 更接近突觸（圖1 d），表明偶聯(lián)的 NK 細(xì)胞被激活。因此，在 5 dyn/cm2 FSS 下，更多的顆粒酶B 被遞送到偶聯(lián)的人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中（圖1 e），這可能解釋了 NK 細(xì)胞對 CTCs 的細(xì)胞毒性增強(qiáng)。

另外 ，NK 細(xì)胞也可以通過分泌細(xì)胞因子（包括 TNF-α、IFN-γ）以及通過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，不同水平的 FSS 下有和沒有腫瘤細(xì)胞時，TNF-α 的分泌沒有顯著差異。有趣的是，與 0 dyn/cm2 相比，IFN-γ 在 1 和 5 dyn/cm2 FSS 時下降。這表明 FSS 不促進(jìn) TNF-α 和 IFN-γ 的分泌。此外，還測試了這些細(xì)胞因子在 FSS 下的細(xì)胞毒作用，發(fā)現(xiàn)有或沒有 TNF-α 和 IFN-γ 時細(xì)胞凋亡沒有差異。在 FSS 下，從懸浮腫瘤細(xì)胞和 NK 細(xì)胞的共培養(yǎng)中收集條件培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)在 1 和 5 dyn/cm2 下沒有細(xì)胞裂解的凈增量，表明 NK 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可能無助于剪切誘導(dǎo)的 NK 細(xì)胞毒性增加。

上述結(jié)果表明，FSS 破壞 NK 和腫瘤細(xì)胞之間的偶聯(lián)物形成，同時促進(jìn) NK 細(xì)胞活化和顆粒酶B 在偶聯(lián)物到靶細(xì)胞的遞送，這可能會增強(qiáng) NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

圖1    FSS促進(jìn)顆粒酶B進(jìn)入靶細(xì)胞。

NKG2D擁有多種配體，包括人類MHC-I類鏈相關(guān)分子（MICA和MICB）和人類UL16結(jié)合蛋白（ULBPs）。接下來，為了測試 NKG2D 在剪切誘導(dǎo)的 NK 細(xì)胞毒性中的作用，探討了 FSS 對 NKG2D 及其配體表達(dá)的影響。有趣的是，剪切處理對 NK 細(xì)胞中 NKG2D 的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平（圖2 a、b）以及 MDA-MB-231 細(xì)胞上的配體（圖2 c）沒有顯著影響。

進(jìn)一步敲低 NK 細(xì)胞中的 NKG2D，發(fā)現(xiàn)沉默 NKG2D 在 5 dyn/cm2 FSS 下顯著降低了細(xì)胞毒性增量（圖2 d）。在 FSS 下，所有腫瘤細(xì)胞和偶聯(lián)細(xì)胞中顆粒酶B 的數(shù)量顯著升高，而 NKG2D 的抑制則減弱了這種效應(yīng)（圖2 e、f）。

由于與靶細(xì)胞上的 MICA 連接后，PI3K 和 VAV1-Grb2 將在銜接蛋白 DAP10和 Gab2 的幫助下被募集到 NKG2D 的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號，然后促進(jìn)顆粒酶B 遞送到靶細(xì)胞中。因此實驗檢測了 FSS 下 PI3K 和 Gab2 信號的激活，發(fā)現(xiàn)與靜態(tài)條件相比，5 dyn/cm2 FSS 促進(jìn)了突觸區(qū)域內(nèi) PI3K 和 Gab2 的磷酸化水平（圖2 g、h），抑制其表達(dá)則減少了剪切誘導(dǎo)的顆粒酶B 到腫瘤細(xì)胞中的遞送。這些結(jié)果表明，FSS 可能通過 NKG2D 介導(dǎo)的顆粒酶B 促進(jìn) NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

圖2    FSS通過NKG2D促進(jìn)顆粒酶B進(jìn)入靶細(xì)胞。

最后，研究探討了 NKG2D 是否能夠直接感知和響應(yīng) FSS。隨著 FSS 的增加，粘附的 NK 細(xì)胞在細(xì)胞膜上表現(xiàn)出 CD107a 表達(dá)升高（圖3 a），這表明 NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性增強(qiáng)。然而，F(xiàn)SS 不能促進(jìn)粘附在整合素 LFA-1 配體 ICAM-1 包被底物的 NK 細(xì)胞中的 CD107a 表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)表明，剪切誘導(dǎo)的 NK 細(xì)胞激活可能是通過直接的 NKG2D-MICA 力感應(yīng)介導(dǎo)的。在與 MICA 相互作用時，NKG2D 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白 DAP10 募集 Grb2-VAV1 和 PI3K 以促進(jìn)免疫突觸形成和 NK 細(xì)胞活化。

酪氨酸蛋白激酶Lck 可磷酸化 VAV1和 PI3K以啟動下游信號傳導(dǎo)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）測量Lck活性發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SS 可以在 NK 細(xì)胞與靶細(xì)胞偶聯(lián)后促進(jìn) Lck 活性。沉默 NKG2D 可減少 FRET 比率的下降，并將 Lck 活性恢復(fù)到對照水平（圖3 b）。FSS 還促進(jìn)了免疫突觸內(nèi)磷酸化 VAV1 的積累，沉默 NKG2D wanquan減弱了 VAV1（圖3 c）。此外，在 FSS 下，PI3K 下游 Akt 的磷酸化顯著增強(qiáng)，敲低 NKG2D 可以抑制這種效應(yīng)（圖3 d）。FSS 還可以促進(jìn)與靶細(xì)胞結(jié)合后NK 細(xì)胞的 MTOC 極化（圖3 d），沉默 NKG2D 則減弱這種效應(yīng)（圖3 e）。這些結(jié)果表明，激活受體 NKG2D 在與 MICA 結(jié)合后可以通過激活下游 Lck/Grb2/VAV1/PI3K 信號來直接感知和響應(yīng) FSS，這可能促進(jìn) NK 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

圖3    NKG2D對FSS具有機(jī)械敏感性。

總之，該研究報道了 FSS 以剪切依賴性方式增強(qiáng) NK 細(xì)胞對 CTCs 的細(xì)胞毒性。腫瘤細(xì)胞死亡的增加歸因于剪切誘導(dǎo)的 NK 細(xì)胞活化，然后將更多的顆粒酶B 輸送到 CTCs 中以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而分泌的細(xì)胞因子和死亡配體的作用是非必要的。重要的是，當(dāng)與配體 MICA 結(jié)合時，NKG2D 可以直接感應(yīng) FSS 以促進(jìn) NK 細(xì)胞活化和細(xì)胞毒性。沉默 NKG2D 消除了 FSS 介導(dǎo)的 NK 細(xì)胞活化、顆粒酶B 遞送和 CTCs 的增量死亡。這些發(fā)現(xiàn)揭示了一種 NK 細(xì)胞對CTC 的機(jī)械調(diào)控殺傷機(jī)制，這可能為基于 NK 細(xì)胞的免疫治療提供一種新的機(jī)械靶向策略。

參考文獻(xiàn)：Hu B, Xin Y, Hu G, Li K, Tan Y. Fluid shear stress enhances natural killer cell's cytotoxicity toward circulating tumor cells through NKG2D-mediated mechanosensing. APL Bioeng. 2023 Aug 11;7(3):036108. doi: 10.1063/5.0156628. PMID: 37575881; PMCID: PMC10423075.

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