Inhibition of the membrane repair protein annexin-A2 prevents tumor invasion and metastasis

Keywords: Annexins; AsPC-1; Invasion; MDA-MB-231; Metastasis; S100 proteins; Tumor progression.

在暴露于機(jī)械應(yīng)力的細(xì)胞中，質(zhì)膜破壞是一種經(jīng)常發(fā)生的生理事件，特別是在肌肉、上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞中，分別受到肌肉收縮/拉伸以及血流動(dòng)力學(xué)剪切應(yīng)力的影響。這些細(xì)胞具有膜修復(fù)機(jī)制，能夠在一分鐘之內(nèi)重新修復(fù)損傷。膜修復(fù)障礙會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并可能導(dǎo)致退行性疾病的發(fā)展，如肌營養(yǎng)不良。Ca2+從細(xì)胞外（mM）流入細(xì)胞內(nèi)（μM）環(huán)境是膜修復(fù)的主要觸發(fā)因素，膜修復(fù)主要依賴于以Ca2+依賴性方式結(jié)合膜的蛋白質(zhì)，如dysferlin、AHNAK、S100家族成員、ESCRT機(jī)制或膜聯(lián)蛋白。

哺乳動(dòng)物的膜聯(lián)蛋白家族是胞質(zhì)蛋白，它們以Ca2+依賴性方式與帶負(fù)電荷的磷脂（例如磷脂酰絲氨酸）結(jié)合，在不同階段參與膜修復(fù)。膜聯(lián)蛋白-A2（ANXA2）有望提供一個(gè)相關(guān)的靶點(diǎn)，因?yàn)樗龠M(jìn)了各種癌癥類型的進(jìn)展，包括乳腺癌、胰腺癌或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。此外，ANXA2在許多細(xì)胞類型（包括癌細(xì)胞）的膜修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用。

癌癥轉(zhuǎn)移是由一系列事件引起的，這些事件導(dǎo)致疾病通過血液或淋巴從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散到其他器官。在這些過程中，癌細(xì)胞暴露于yongjiu性機(jī)械應(yīng)力下，這些應(yīng)力在幾何形狀、規(guī)模和強(qiáng)度上都發(fā)生了變化，這取決于它們參與的轉(zhuǎn)化。從原發(fā)腫瘤的體積壓縮開始，當(dāng)轉(zhuǎn)移細(xì)胞在血流中移動(dòng)時(shí)，機(jī)械限制演變?yōu)檠鲃?dòng)力學(xué)和機(jī)械剪切應(yīng)力，zuihou當(dāng)它們到達(dá)非常狹窄的血管并發(fā)展到整個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞的外滲時(shí)，演變?yōu)檎掣叫岳旌途o密性收縮。這些機(jī)械應(yīng)力很容易在癌細(xì)胞中造成質(zhì)膜破壞，亟需一種youxiao的膜修復(fù)機(jī)制來應(yīng)對這種損傷，這將為開發(fā)新的治療策略開辟道路，以阻止腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。

去年，法國波爾多大學(xué)及法國國家科學(xué)研究中心和法國國家與健康醫(yī)學(xué)研究院的科研團(tuán)隊(duì)開展了評估癌細(xì)胞中關(guān)鍵膜修復(fù)蛋白的抑制是否會影響體內(nèi)腫瘤進(jìn)展的研究。這項(xiàng)研究使用了具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性的三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1，發(fā)現(xiàn)當(dāng)將這些細(xì)胞注射到小鼠或斑馬魚中時(shí)，ANXA2的基因抑制可以阻止腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程；并證明ANXA2的缺失可抑制癌細(xì)胞對剪切應(yīng)力的反應(yīng)，這導(dǎo)致細(xì)胞由于缺乏膜修復(fù)而死亡；而且ANXA2單克隆抗體干擾了ANXA2在癌細(xì)胞膜修復(fù)中的功能，表明它可能構(gòu)成抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)工具。研究成果發(fā)表在Cellular and Molecular Life Sciences期刊題為“Inhibition of the membrane repair protein annexin-A2 prevents tumor invasion and metastasis"。

首先，為了探索膜聯(lián)蛋白在乳腺癌中的影響，比較了MDA-MB-231和MCF7細(xì)胞（侵襲性較低）中ANXA1、ANXA2和ANXA4的蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)（圖1 A、B），發(fā)現(xiàn)ANXA1和ANXA2在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)水平高于MCF7細(xì)胞。這表明，膜修復(fù)基因的高表達(dá)可能有助于激素受體陰性乳腺腫瘤更具侵襲性的表型。此外，在AsPC-1胰腺癌細(xì)胞中也驗(yàn)證了ANXA2的高表達(dá)。鑒于其在測試的膜聯(lián)蛋白中表達(dá)最高，因此后續(xù)研究集中關(guān)注ANXA2。

通過沉默ANXA2的表達(dá)，檢測了shANXA2 MDA-MB-231和shANXA2 AsPC-1細(xì)胞在體外修復(fù)膜損傷的能力（圖1 C-F）。蛋白質(zhì)印跡證實(shí)，shANXA2細(xì)胞中，ANXA2蛋白表達(dá)強(qiáng)烈降低（圖1 C），且沉默ANXA2表達(dá)后細(xì)胞形態(tài)沒有顯著差異（圖1 D）。此外，ANXA2缺失對細(xì)胞增殖沒有影響，但可能會輕微干擾體外遷移。

為了確認(rèn)MDA-MB-231和AsPC-1細(xì)胞的膜修復(fù)需要ANXA2，在Ca2+和FM1-43存在下進(jìn)行了膜修復(fù)測定。在對照MDA-MB-231或AsPC-1細(xì)胞中，觀察到FM1-43在激光損傷后幾秒鐘內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞的膜照射部位，證實(shí)了膜破裂的存在（圖1 E）。120秒后，大多數(shù)受損細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)熒光的增加（圖1 E），強(qiáng)度增加約60s后達(dá)到平臺期（圖1 F），表示質(zhì)膜的快速重新密封。相反，shANXA2 MDA-MB-231或shANXA2 AsPC-1細(xì)胞的熒光強(qiáng)度增加幅度要大得多（圖1 G-F），表示沒有質(zhì)膜重封。

為了測試ANXA2是否被募集到損傷部位，用ANXA2-GFP載體轉(zhuǎn)染shANXA2 MDA-MB-231細(xì)胞，并通過激光消融分析膜損傷后ANXA2的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，觀察到ANXA2-GFP在幾秒鐘內(nèi)被一致地募集到膜破壞位點(diǎn)（圖1 H、I）。這些數(shù)據(jù)表明，ANXA2是MDA-MB-231和AsPC-1細(xì)胞膜修復(fù)所必需的。

圖1    ANXA2在MDA-MB-231細(xì)胞中高度表達(dá)，促進(jìn)膜修復(fù)。

接下來，檢測了剪切應(yīng)力后膜修復(fù)的差異。在沒有Ca2+的情況下，13.6±2.3%的細(xì)胞在暴露于剪切應(yīng)力后未修復(fù)，該值遠(yuǎn)高于沒有應(yīng)用剪切應(yīng)力時(shí)（0.7±0.5%）（圖2 B、E、F）。Ca2+存在時(shí)，該值下降到3.8±1.9%，表明約70%的對照細(xì)胞能夠修復(fù)膜損傷（圖2 B、E、F）。電子顯微鏡觀察剪切應(yīng)力處理后MDA-MB-231細(xì)胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)承受剪切應(yīng)力的許多細(xì)胞在Ca2+存在下似乎已經(jīng)裂解，在沒有Ca2+的情況下這種現(xiàn)象會增加，表明這是由未修復(fù)的膜損傷引起的。這些結(jié)果表明，剪切應(yīng)力會造成膜損傷，其修復(fù)需要Ca2+。

然后，檢測了沉默ANXA2表達(dá)后對剪切應(yīng)力的響應(yīng)。在Ca2+存在時(shí)，11.3 ± 5.9%的shANXA2 MDA-MB-231細(xì)胞在剪切應(yīng)力下未能修復(fù)其膜，與沒有Ca2+時(shí)對照細(xì)胞的值相似（圖2 C、E、F），在ANXA2沉默的AsPC-1細(xì)胞中也觀察到這種膜修復(fù)缺陷。電子顯微鏡觀察到大多數(shù)shANXA2 MDA-MB-231細(xì)胞似乎已經(jīng)裂解，就像沒有Ca2+一樣。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，剪切應(yīng)力會導(dǎo)致膜損傷，其修復(fù)需要ANXA2。

此外，實(shí)驗(yàn)還檢查了抗-ANXA2抗體抑制膜修復(fù)的能力。研究假設(shè)抗體會通過被破壞的膜進(jìn)入細(xì)胞，并通過中和ANXA2來抑制膜修復(fù)。對照MDA-MB-231細(xì)胞在Ca2+和單克隆抗ANXA2抗體存在下承受剪切應(yīng)力。結(jié)果觀察到，8.7% ± 3.0%的未修復(fù)細(xì)胞，明顯高于在Ca2+存在下受損的對照細(xì)胞的值，并推斷抗-ANXA2抗體的存在導(dǎo)致剪切應(yīng)力后膜修復(fù)缺陷（圖2 D-F）?？?ANXA2抗體在膜修復(fù)中的抑制作用在AsPC-1細(xì)胞中也得到證實(shí)。因此得出結(jié)論，ANXA2是響應(yīng)剪切應(yīng)力的關(guān)鍵成分，并且抗-ANXA2抗體盡管在細(xì)胞外給藥，但可以抑制膜修復(fù)。

圖2對照和shANXA2 MDA-MB-231細(xì)胞對剪切應(yīng)力下膜損傷的反應(yīng)。

zuihou，研究人員使用transwell侵襲測定法討論了ANXA2沉默對MDA-MB-231和AsPC-1細(xì)胞遷移的影響（圖3 A）。在沒有ANXA2的情況下，覆蓋有基質(zhì)膠和膠原蛋白插入物的下腔室中的MDA-MB-231細(xì)胞數(shù)量分別減少了72%和62%（圖3 B）。類似的結(jié)果在AsPC-1細(xì)胞中觀察到。這表明，ANXA2的缺失降低了MDA-MB-231和AsPC-1細(xì)胞的侵襲性。

此外，為了研究ANXA2在腫瘤進(jìn)展中的作用，用熒光素酶報(bào)告基因標(biāo)記對照和shANXA2 MDA-MB-231細(xì)胞，并將細(xì)胞注射到NOD SCID小鼠和RAG小鼠的尾靜脈中，發(fā)現(xiàn)缺乏ANXA2的細(xì)胞在肺部的定植效率要差得多，并且無法移植到骨骼中。這說明，ANXA2是小鼠轉(zhuǎn)移所必需的。為了確認(rèn)ANXA2缺失細(xì)胞轉(zhuǎn)移的較低傾向，將對照或shANXA2 MDA-MB-231細(xì)胞和對照或shANXA2 AsPC-1細(xì)胞注射到斑馬魚幼蟲的卵黃囊中，并量化在魚尾部和/或頭部形成的轉(zhuǎn)移，也證實(shí)了ANXA2是斑馬魚細(xì)胞植入和轉(zhuǎn)移所必需的。

圖3     ANXA2缺乏會損害MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲。

總之，該研究表明，膜聯(lián)蛋白-A2（ANXA2）是侵襲性乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞膜修復(fù)所必需的。從機(jī)制上講，通過熒光和電子顯微鏡表明，當(dāng)ANXA2沉默或被中和抗體抑制時(shí)，細(xì)胞無法重新密封剪切應(yīng)力造成的損傷膜。沉默ANXA2對體外增殖沒有影響，甚至可能加速傷口愈合試驗(yàn)中的遷移，但會減少小鼠和斑馬魚中的腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散。研究人員預(yù)測，抑制膜修復(fù)在對侵襲性、預(yù)后不良的腫瘤中特別youxiao，因?yàn)樗鼈円揽磕ば迯?fù)機(jī)制在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移期間來維持膜損傷。這可以通過抗-ANXA2抗體來實(shí)現(xiàn)，抗-ANXA2抗體已被證明可以抑制乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，也可以使用小分子藥物來實(shí)現(xiàn)。

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