Mechanoresponsive ETS1 causes endothelial dysfunction and arterialization in varicose veins via NOTCH4/DLL4 signaling

Keywords: ETS; Endothelium; Notch; Shear stress; Therapeutics; Varicose veins.

慢性靜脈疾病，通常稱為靜脈曲張，其特征是靜脈血回流不足，嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)包括出血和皮膚潰爛經(jīng)久不愈。最近的研究報(bào)告稱，靜脈曲張與靜脈血栓栓塞和外周動(dòng)脈疾病的高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。

當(dāng)靜脈暴露于流量較高或血流變化的循環(huán)時(shí)，會(huì)發(fā)生組織學(xué)變化，例如內(nèi)膜增生、管壁增厚、靜脈內(nèi)皮標(biāo)志物丟失和動(dòng)脈內(nèi)皮標(biāo)志物表達(dá)。這個(gè)過程稱為異常靜脈動(dòng)脈化。研究表明，隱靜脈的動(dòng)脈化有助于靜脈曲張的發(fā)病機(jī)制。此外，發(fā)現(xiàn)與Notch信號(hào)通路相關(guān)的動(dòng)脈內(nèi)皮標(biāo)志物，如DLL4、HEY2和ephrin B2，在靜脈曲張中增加。靜脈曲張中功能失調(diào)的單向瓣膜和靜脈壁擴(kuò)張會(huì)導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)改變，盡管在發(fā)病機(jī)制的初級階段是很微妙的。同時(shí)，血壓和剪切應(yīng)力等生物力學(xué)力是Notch信號(hào)傳導(dǎo)的gongren決定因素，然而，力檢測的機(jī)制及其與Notch激活的耦合是未知的。

靜脈血流力學(xué)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制知之甚少。最近，機(jī)械敏感的 E26 轉(zhuǎn)化特異性序列-1（ETS1）被證明與 Notch 復(fù)合物結(jié)合并誘導(dǎo)內(nèi)皮 NOTCH1 和 NOTCH4 受體以及 DLL4 配體。ETS1表達(dá)及其DNA結(jié)合活性與高動(dòng)脈剪切應(yīng)力相關(guān)。

最近，印度拉吉夫-甘地生物技術(shù)中心及Sri Jayadeva 心血管科學(xué)研究所的課題團(tuán)隊(duì)研究了ETS1在人靜脈曲張中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)了 ETS1 如何在擾動(dòng)流體剪切應(yīng)力下調(diào)節(jié)靜脈 ECs中 Notch 受體及其相應(yīng)配體的表達(dá)譜。此外，還檢查了與對照隱靜脈相比，靜脈曲張中活化Notch受體和其配體的表達(dá)是否增強(qiáng)以及靜脈血流紊亂是否在與靜脈動(dòng)脈化相關(guān)的分子變化中起作用。研究成果發(fā)表在 European Journal of Cell Biology 期刊題為“Mechanoresponsive ETS1 causes endothelial dysfunction and arterialization in varicose veins via NOTCH4/DLL4 signaling"。

首先，為了在靜脈曲張發(fā)病機(jī)制的背景下檢查Notch信號(hào)，使用qRT-PCR分析了靜脈曲張和對照隱靜脈中Notch受體和配體的相對基因表達(dá)。結(jié)果表明，與健康靜脈相比，靜脈曲張中的NOTCH1（1.41倍）、NOTCH3（1.47倍）和NOTCH4（2.42倍）顯著上調(diào)，編碼Notch配體（如DLL3、DLL4和JAG1）的基因也上調(diào)。組織學(xué)分析表明，與正常靜脈相比，靜脈曲張的內(nèi)層增厚，具有明顯的內(nèi)膜形成，表明靜脈壁動(dòng)脈化。免疫染色分析顯示，活化的裂解Notch受體（NICD1、NICD3、NICD4）和DLL4和JAG1在靜脈曲張中的表達(dá)顯著升高。通過蛋白質(zhì)印跡和密度測定法進(jìn)一步定量了對照靜脈和靜脈曲張中NICD4 和 DLL4 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們在靜脈曲張中的上調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

然后，評估了 ETS1 在靜脈曲張和對照靜脈中的表達(dá)。結(jié)果表明，靜脈曲張中ETS1 mRNA轉(zhuǎn)錄本上調(diào)（1.86倍），表明ETS1在疾病進(jìn)展中起關(guān)鍵作用（圖1 A）。ETS1 通過其蘇氨酸-38 殘基的磷酸化而被激活。使用 ETS1 pThr38 和 ETS1 總抗體的蛋白質(zhì)印跡分析顯示，磷酸化的 ETS1（pETS1）在靜脈曲張組織勻漿中的表達(dá)顯著高于正常靜脈（圖1 B、C）。

免疫組化定位顯示，細(xì)胞核pETS1在人靜脈曲張的所有組織層中均有顯著表達(dá)（圖1 D、E），但對照靜脈中沒有ETS1的核表達(dá)。通過驗(yàn)證pETS1的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)ETS1確實(shí)定位于細(xì)胞核，并在靜脈曲張的新內(nèi)膜區(qū)域密集染色，而在對照靜脈中未顯著顯示其表達(dá)（圖1 D、F、G）。此外，在對照靜脈和靜脈曲張中共定位 EC 標(biāo)志物 CD31 與 pETS1，發(fā)現(xiàn)與對照靜脈相比，CD31 在靜脈曲張中顯著下調(diào)，然而，在靜脈曲張中，細(xì)胞質(zhì) CD31 與核 pETS1 共表達(dá)。

圖1     靜脈曲張中 ETS1 的上調(diào)。

接下來，將血管內(nèi)皮細(xì)胞珠EA.hy926 暴露于剪切應(yīng)力（6 dyne/cm2）以探索機(jī)械敏感 Notch 蛋白和 ETS1 在各種流體流動(dòng)條件下的潛在表達(dá)。細(xì)胞經(jīng)受不同的剪切應(yīng)力狀態(tài)（靜態(tài)、PF 和 DF），以模擬正常和受影響靜脈中管腔內(nèi)皮對血流模式的反應(yīng)。qRT-PCR分析不同剪切應(yīng)力條件下細(xì)胞中NOTCH1-4、Notch配體（DLL3、DLL4、JAG1、JAG2）和ETS1的基因表達(dá)（圖2 A），發(fā)現(xiàn)擾動(dòng)剪切應(yīng)力（DF）在靜脈 ECs 中誘導(dǎo) NOTCH4、DLL4、JAG1和 ETS1的顯著表達(dá)（圖2 A）。

蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)，與均勻平行流動(dòng)（PF）和靜態(tài)條件相比，DF細(xì)胞中活化的NOTCH4（NICD4）和DLL4表達(dá)穩(wěn)定增加（圖2 B）。與平行流動(dòng)的細(xì)胞相比，暴露于DF的細(xì)胞中活化的pETS1的表達(dá)顯著升高（圖2 C）。為了評估 EA.hy926 細(xì)胞的完整性，檢測了EC 標(biāo)志物 CD31 和 eNOS，發(fā)現(xiàn)與PF和靜態(tài)細(xì)胞相比，DF細(xì)胞中CD31和活化的peNOS蛋白逐漸減少（圖2 B、C）。

對暴露于流動(dòng)條件的 ECs 進(jìn)行 NICD1、NICD4、pETS1 和 DLL4 的免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)NICD1 在靜態(tài)、PF 或 DF 的細(xì)胞中均無差異（圖2 D、E）。這些結(jié)果證實(shí)了暴露于各種流動(dòng)條件的細(xì)胞中的NOTCH1 mRNA的水平。NICD1雖然是一種內(nèi)皮型，但在靜態(tài)、PF或DF的細(xì)胞中沒有差異（圖2 D、E），然而，暴露于 DF 的 NICD4 和 pETS1 的表達(dá)顯著增加，并有明顯的核定位（圖2 D、E、F）。Notch 配體 DLL4 表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)模式。盡管 ETS1 mRNA 在暴露于 DF 的細(xì)胞中高表達(dá)，但 ETS1 總蛋白的差異表達(dá)在不同流動(dòng)條件的細(xì)胞中并不顯著（圖2 B）。

圖2     ETS1-Notch4/DLL4 在擾動(dòng)流體剪切應(yīng)力下靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（EC）中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

最后，為了進(jìn)一步了解 ETS1 蘇氨酸38 在靜脈血流改變下的磷酸化機(jī)制，研究人員探索了某些抑制劑，如 U0126（MEK1/2 抑制劑）、BIX02189（MEK5 抑制劑）和 SB203580（P38 MAPK 抑制劑）對暴露于 DF 的 ECs 的影響。結(jié)果表明，U0126 顯著降低 pETS1 核表達(dá)，突出了 MEK1/2 信號(hào)在 ETS1 激活中的重要性。在隨后的擾動(dòng)剪切應(yīng)力刺激下，U0126 處理的細(xì)胞中 pETS1 降低。MEK5 抑制劑也導(dǎo)致 pETS1 減少，表明 MEK1/2 和 MEK5 在響應(yīng) DF 的 ETS1 磷酸化中存在潛在的相互作用。然而，P38 MAPK通路似乎在DF下的pETS1表達(dá)中沒有作用。這表明，擾動(dòng)流主要通過 MEK1/2 級聯(lián)誘導(dǎo) ETS1。

然后，敲低 EA.hy926 細(xì)胞中 ETS1 的表達(dá)，將有或沒有 ETS1 敲低（ETS1KD）的 ECs 暴露于剪切應(yīng)力。當(dāng) ETS1KD ECs 受到擾動(dòng)剪切應(yīng)力時(shí)，ETS1 mRNA 水平持續(xù)降低（圖3 B）。此外，在擾動(dòng)流條件下，ETS1 的缺失顯著降低了 NICD4 和 DLL4 蛋白水平（圖3 A）。

使用 TK216（ETS抑制劑）化學(xué)抑制 ETS1 結(jié)合活性，發(fā)現(xiàn)NICD4和DLL4水平降低，與ETS1KD細(xì)胞所觀察的一致（圖3 C）。此外，與擾動(dòng)剪切應(yīng)力下的對照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，ETS1KD細(xì)胞中的NICD4和DLL4蛋白分別降低了5.75倍和4.49倍；與未處理和DF 處理24小時(shí)的細(xì)胞相比，TK216處理的ECs分別降低了5.27倍和6.44倍（圖3 D）。值得注意的是，即使在 DF 下，用 TK216 處理也會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮基因的表達(dá)升高，特別是 eNOS、VE-鈣粘蛋白和 vWF（圖3 E）。這些數(shù)據(jù)表明，暴露于靜脈血流紊亂的細(xì)胞中 ETS1 的分子和化學(xué)抑制消除了 Notch 信號(hào)。

圖3    pETS1 促進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（EC）中剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 Notch 活化。

圖4    圖形概要

總之，該研究目前的研究結(jié)果為擾動(dòng)靜脈剪切應(yīng)力在靜脈曲張中誘導(dǎo)異常 NOTCH4/DLL4 信號(hào)傳導(dǎo)中的作用提供了寶貴的見解。機(jī)械敏感轉(zhuǎn)錄因子 ETS1 已被確定為 NOTCH4/DLL4 誘導(dǎo)的靜脈曲張信號(hào)的激活劑，可能是調(diào)節(jié)靜脈曲張動(dòng)脈化的有希望的靶標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：Sreelakshmi BJ, Karthika CL, Ahalya S, Kalpana SR, Kartha CC, Sumi S. Mechanoresponsive ETS1 causes endothelial dysfunction and arterialization in varicose veins via NOTCH4/DLL4 signaling. Eur J Cell Biol. 2024 May 11;103(2):151420. doi: 10.1016/j.ejcb.2024.151420. Epub ahead of print. PMID: 38759515.

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