大腦的穩(wěn)態(tài)由一種稱為血腦屏障（BBB）的特殊結構維持。BBB 是一種復雜的三維結構，由腦微血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和周細胞組成。星形膠質(zhì)細胞突起末端形成膨大的終足，包圍著內(nèi)皮細胞，被認為有助于維持血腦屏障。這種復合物的屏障性質(zhì)由特化的腦內(nèi)皮細胞維持，形成緊密的連接復合體，包括緊密連接和粘附連接。

BBB 的正常功能對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的正常和調(diào)節(jié)功能至關重要。多項研究表明，BBB 的破壞與阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)生有關。此外，神經(jīng)炎癥已被證明會損害 BBB 并導致 AD 的進一步發(fā)展。已知幾種外周代謝紊亂，如高血糖癥、糖尿病和心血管疾病，是導致血腦屏障破壞的原因，也會對 BBB 的完整性提出挑戰(zhàn)。

由于 BBB 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和藥理學研究中的關鍵作用，BBB 模型是必要的組成部分。目前，已經(jīng)開發(fā)了幾種 BBB 模型，從單培養(yǎng)模型到共培養(yǎng)模型到更復雜的模型，如使用動物和人類細胞類型的球體和芯片模型。復雜的模型使用細胞的 3D 組織來代表 BBB 結構，并模擬腦血流。盡管有這些優(yōu)點，但它們很難設置，重要的是，價格昂貴。因此，Transwell 小室共培養(yǎng)系統(tǒng)提供了一種更簡單、更具成本效益和功能性的 BBB 模型。在韓國慶尚國立大學應用生命科學系、荷蘭馬斯特里赫特大學精神病學和神經(jīng)心理學系課題組的一項研究中，描述了一種接觸式共培養(yǎng)體外模型，使用小鼠腦內(nèi)皮細胞系和星形膠質(zhì)細胞系在小室培養(yǎng)，該系統(tǒng)為各種神經(jīng)學研究場景提供了一個兼具高效性和功能性的平臺。研究成果發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“Establishing Co-Culture Blood-Brain Barrier Models for Different Neurodegeneration Conditions to Understand Its Effect on BBB Integrity"。

首先，將腦微血管內(nèi)皮細胞系 bEnd.3 和星形膠質(zhì)細胞系 C8-D1A 在小室中進行接觸共培養(yǎng)，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)在頂部，而 C8-D1A 細胞接種在小室的基底外側(cè)（圖1 A-C）。粘附在膜兩側(cè)的細胞通過膜的微孔利用突出的終足顯示出細胞間通訊。電子顯微鏡圖像顯示星形膠質(zhì)細胞終足穿過孔膜的證據(jù)（圖1 D、F）。該特性模擬了實際的 BBB，其中星形膠質(zhì)細胞終足與內(nèi)皮細胞接觸（圖1 F）。

圖1    建立BBB模型的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)。

（A）時間線示意圖代表bEnd.3 和 C8-D1A 細胞在小室的頂端和基底外側(cè)接種以獲得體外接觸共培養(yǎng) BBB 模型。（B）體外完整接觸共培養(yǎng)BBB模型的圖示。（C）蘇木精和伊紅（H&E）染色的transwell 膜顯示在頂端和基底外側(cè)粘附的 bEnd.3 和 C8-D1A 細胞。（D-F）掃描電子顯微照片顯示bEnd.3 細胞和C8-D1A 細胞，放大顯微照片顯示基底外側(cè)的 C8-D1A 細胞終足穿過 0.4 μm 孔（白色箭頭）到達transwell膜頂端的 bEnd.3 細胞。

在建立共培養(yǎng)的BBB模型后，實驗檢測了其屏障功能和性能。首先，分析單培養(yǎng)和共培養(yǎng)的 C8-D1A 和 bEnd.3 細胞的跨膜電阻值（TEER）值。TEER 值是膜滲透性的一個重要指標，滲透性越高 TEER 越低，它的變化能夠反映膜的緊密連接功能。結果表明，共培養(yǎng)比單培養(yǎng)顯示出更高的 TEER 值。此外，由于細胞的融合性，TEER 值隨時間推移而增加，表明與單獨培養(yǎng)的細胞相比，transwell 共培養(yǎng)顯示出zui大的抗?jié)B透性。因此，共培養(yǎng)的 BBB 模型可顯示出有效的屏障功能和性能，說明目前的體外共培養(yǎng)模型可表征完整 BBB 特征。

然后，在單（不含 C8-D1A）和共（含 C8-D1A）培養(yǎng)模型中分析 ZO-1、occludin-1 和 caludin-5 等緊密連接蛋白的表達，以評估細胞間粘附。Western blot 分析表明，共培養(yǎng)模型中所有上述緊密連接蛋白的表達量都比單培養(yǎng)模型高 1.5-2 倍（圖2 A）。此外，熒光免疫組化分析驗證了這一發(fā)現(xiàn)，與單培養(yǎng)模型相比，共培養(yǎng)模型中的 ZO-1 表達增強（圖2 B）。這說明，共培養(yǎng)模型顯示出增強的細胞間粘附。

圖2    共培養(yǎng)中腦內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出增強的緊密連接蛋白表達。

接下來，將 PA-BSA（牛血清白蛋白偶聯(lián)棕櫚酸）暴露于共培養(yǎng)模型 24h 來建立體外肥胖模型。免疫熒光結果顯示，ZO-1水平顯著下降。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，緊密連接蛋白，包括 ZO-1、occludin-1 和 claudin-5 在 PA-BSA 處理的細胞中表達水平也顯著下降。此外，通過測量 BBB 兩端的電阻，分析了 PA-BSA 對 BBB 完整性的惡化影響。TEER 分析進一步證實了 PA-BSA 暴露顯著破壞了 BBB 的電阻，從而表明 BBB 結構減弱。這說明，暴露于棕櫚酸會模擬肥胖并破壞 BBB 的緊密連接。

神經(jīng)炎癥的特征包括負責分泌白細胞介素和細胞因子的小膠質(zhì)細胞的激活。為了模擬這種情況，將共培養(yǎng)模型暴露于富含促炎白細胞介素和細胞因子的小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基（MCM）。免疫熒光分析顯示，與對照組相比，MCM 組的 ZO-1 表達下降，星形膠質(zhì)細胞損傷標志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達顯著增加（圖3 A、B）。通過蛋白質(zhì)印跡驗證了這一發(fā)現(xiàn)，與未暴露的對照組相比，MCM 暴露后緊密連接蛋白的水平顯著下降，而 GFAP 表達增加（圖3 C、D）。

使用TEER分析了 BBB 完整性，發(fā)現(xiàn)暴露于 MCM 后屏障能力迅速下降（圖3 E）。這說明，神經(jīng)炎癥影響血腦屏障通透性的下降。

圖3    促炎反應對血腦屏障的影響。

目前，普遍認為 β-淀粉樣蛋白（Aβ）是構成 AD 主要病理特征，在細胞基質(zhì)沉淀聚積后具有很強的神經(jīng)毒性作用。研究人員使用 bEnd.3 細胞（頂部）、C8-D1A 細胞（基底膜外側(cè)）和 HT22 細胞（下室），創(chuàng)建了具有三種共培養(yǎng)細胞系的 AD 樣病理學的體外模型。HT22 細胞用淀粉樣前體蛋白過表達質(zhì)粒 pCAX APPswe/ind 轉(zhuǎn)染或暴露于溶解在培養(yǎng)基中的 Aβ（1-42）多肽中進行 TEER 分析以檢測 Aβ 毒性的作用。

與對照組相比，單培養(yǎng)模型中 ZO-1 表達水平在暴露于 Aβ 的細胞數(shù)量中顯著降低（圖4 A）。此外，單培養(yǎng)模型中的緊密連接蛋白表達水平也顯著下調(diào)（圖4 B）。在暴露于 Aβ 的共培養(yǎng)模型中，TEER 分析也顯示屏障功能迅速下降（圖4 C），且緊密連接蛋白表達顯示出相似的下降趨勢（圖4 D）。Aβ 注射小鼠額葉皮層和海馬區(qū)的 Western blot 分析顯示，ZO-1 蛋白表達水平明顯低于對照組（圖4 E）。Aβ 共定位在特定的大腦區(qū)域，這證實了 Aβ 的毒性，以及在 Aβ 誘導的 AD 模型中觀察到的緊密連接蛋白表達水平。這些數(shù)據(jù)表明，β淀粉樣蛋白病理學導致血腦屏障破壞。

圖4    淀粉樣蛋白對腦內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞的毒性。

在這項研究中，開發(fā)了一種結合腦內(nèi)皮細胞（bEnd.3）和星形膠質(zhì)細胞（C8-D1A）的 transwell 共培養(yǎng)模型?？傮w而言，與僅內(nèi)皮細胞模型（單培養(yǎng)）相比，共培養(yǎng)模型顯示出更好的 BBB 結構和功能完整性，以及更高的緊密連接蛋白水平。此外，共培養(yǎng)模型表明，一旦暴露于上述疾病環(huán)境，其完整性和緊密連接蛋白水平就會降低。

該研究建立的體外模型，包括對物理特性、滲透性、TEER 評估和緊密連接蛋白的表達分析，而且已被用于模擬不同的大腦狀況。研究人員證明，該模型是一種出色的體外血腦屏障模型，可應用于與血腦屏障完整性相關的多種疾病研究。未來，將可以作為研究復雜生理狀況的便捷工具，以及治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物作用模型，如阿爾茨海默病、帕金森病、缺血、TBI和腦代謝紊亂。

參考文獻：Park JS, Choe K, Khan A, Jo MH, Park HY, Kang MH, Park TJ, Kim MO. Establishing Co-Culture Blood-Brain Barrier Models for Different Neurodegeneration Conditions to Understand Its Effect on BBB Integrity. Int J Mol Sci. 2023 Mar 9;24(6):5283. doi: 10.3390/ijms24065283. PMID: 36982361; PMCID: PMC10049378.

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