血管生成，涉及從預先存在的毛細血管中萌發(fā)新的血管，有助于胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和傷口愈合。血管生成或血管修復的調(diào)控缺失是動脈粥樣硬化的嚴重并發(fā)癥。此外，血管生成異常限制了缺血性疾病的組織恢復。因此，血管生成在心血管疾病中具有巨大的血管再生潛力。

細胞行為和命運由機械微環(huán)境決定。內(nèi)皮細胞（ECs）的特定機械轉(zhuǎn)導機制參與調(diào)節(jié)細胞命運，從而塑造血管系統(tǒng)以優(yōu)化流向組織的血流。研究發(fā)現(xiàn)，剪切應力有效調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細胞（EPCs），在促進血管生成方面具有巨大潛力。還有報告稱，增加的剪切應力通過靜脈叢中的 BMP-依賴性途徑抑制血管生成。因此，剪切應力因其在血管再生中的潛在作用而得到認可。然而，不同的血流模式（層流和擾動流）如何決定血管生成在很大程度上仍不清楚。

遷移和侵襲增強子1（MIEN1）是一種在腫瘤組織中廣泛表達的新基因，對細胞的侵襲和遷移具有重要的控制作用。此外，MIEN1 維持肌動蛋白細胞骨架的可塑性以增強細胞運動性。EC 的遷移對血管生成至關重要，血管生成受機械刺激的定向調(diào)控。EC 對剪切應力的響應涉及重塑肌動蛋白細胞骨架的多種信號通路的激活，從而促進 EC 的遷移。在血管生成萌芽期間控制 EC 行為的各種信號通路中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號在調(diào)節(jié)血管生成中起著至關重要的作用。最近，MAPK 信號被證明與血管重塑和發(fā)芽有關。

最近，在四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究室課題人員的一項工作中，初步研究了不同血流模式（生理LSS：15 dyn/cm2；促動脈粥樣硬化血流DSS：0.5 ± 4 dyn/cm2）對體外血管生成的影響，探討了不同血流模式下內(nèi)皮血管生成的變化及其潛在機制。研究結(jié)果顯示，通過 MIEN1-ERK/MAPK 信號轉(zhuǎn)導軸，擾動流顯著損害了 ECs 的血管生成。這些結(jié)果為擾動剪切應力對血管生成的影響提供了直接的見解。詳細研究成果發(fā)表在 The Journal of Cellular Physiology 期刊題為“Hemodynamic force dictates endothelial angiogenesis through MIEN1-ERK/MAPK-signaling axis"。

首先，研究了響應不同 FSS 模式的血管樣結(jié)構(gòu)的形成，發(fā)現(xiàn)與擾動流相比，層流中形成的 HUVECs 的血管樣結(jié)構(gòu)更多。VEGF 被認為是血管生成的重要介質(zhì)，能夠刺激血管生成萌芽，包括 VEGFA，VEGFB，VEGFC 和 VEGFD 多種亞型，因此，檢測了四種亞型的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達。結(jié)果表明，與 LSS 相比，DSS 中 VEGFB mRNA 水平下調(diào)，而 VEGFA、C 和 D 的 mRNA 表達顯著增加。蛋白質(zhì)檢測結(jié)果顯示，與 LSS 相比，DSS 中 VEGFB 的表達較低，而兩組之間的 VEGFA、C 和 D 表達無顯著差異。免疫熒光分析證實，與 LSS 相比，DSS 下 HUVECs 的細胞質(zhì)和膜區(qū)域中的 VEGFB 分布顯著降低（圖1 f、g）。

進一步探究 VEFGB 對 FSS 的影響，用 10 ng/mL VEGFB 誘導后，可以發(fā)現(xiàn) ECs 在擾動流條件下傾向于形成血管樣結(jié)構(gòu)（圖1 h）。定量分析證實，誘導擾動組的血管小管和腎小管面積相對對照組增加（圖1 i）。相反，靜態(tài)組和層流組在有或沒有 VEGFB 處理的情況下沒有差異。這些結(jié)果表明，DSS 通過降低 HUVECs 中 VEGFB 的表達來破壞血管生成過程。

圖1    Matrigel上 HUVECs 的血管生成響應不同模式的 FSS。

接下來，為了探究剪切應力誘導血管生成的機械轉(zhuǎn)導機制，實驗重點關注了不同流動模式條件下細胞膜和細胞骨架的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HUVECs 中響應 DSS 的基因數(shù)量減少，特別是 MIEN1 在 DSS 中的 mRNA 和蛋白水平均顯著降低。通過免疫熒光探索 HUVECs 中 MIEN1 的分布（圖2 e、f），觀察到 LSS 組中大量 MIEN1 高表達。此外，MIEN1 在 HUVECs 中呈點狀分布，主要分散在 LSS 組的細胞質(zhì)和膜區(qū)域。

為了研究 MIEN1 在剪切應力介導的血管生成中的作用，用 MIEN1 siRNA 轉(zhuǎn)染 HUVECs 降低 MIEN1 蛋白的表達（圖2 a、b、c）。上述結(jié)果表明，DSS 導致 HUVECs 中 VEGFB 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達降低。因此，接下來確定 MIEN1 是否是 VEGFB 表達所必需的。數(shù)據(jù)證實，si-MIEN1 減弱了 VEGFB 的表達，進一步突出了 MIEN1 在此過程中的重要性（圖2 b、d）。同時，進行 MIEN1 的過表達也證實了上述結(jié)果，顯示 MIEN1 的上調(diào)顯著增強了 VEGFB 的表達。

研究證實，暴露于 LSS 的 ECs 表現(xiàn)出比 DSS 更高的 F-肌動蛋白表達水平。因此，研究了不同流動條件下 HUVECs 中微絲的分布。暴露于層流中，HUVECs 顯示出明顯且明確的絲狀 F-肌動蛋白結(jié)構(gòu)，然而在擾動流下，F(xiàn)-肌動蛋白出現(xiàn)分散。隨后使用 si-MIEN1 敲低 MIEN1，發(fā)現(xiàn) LSS 和 DSS 組內(nèi)細胞骨架組織都受到干擾（圖2 e）。此外，MIEN1 的降低擾亂了細胞骨架在微絲（F-肌動蛋白束）形成中的組織（圖2 g）。定量分析顯示，與 LSS 組相比，DSS 組中 F-肌動蛋白的熒光強度降低（圖2 f）。一般來說，DSS 破壞了細胞骨架的結(jié)構(gòu)完整性。然而，MIEN1 過表達組在 DSS 條件下表現(xiàn)出增強的細胞骨架組織能力。

隨后，探討了 MIEN1 在血管生成中的作用。在 LSS 組中，用 si-MIEN1 轉(zhuǎn)染明顯抑制了血管樣結(jié)構(gòu)的形成（圖2 h）。在層流條件下，血管連接處和腎小管面積均降低（圖2 i）。有趣的是，與 DSS 相比，MIEN1 的過表達促進了細胞中血管樣結(jié)構(gòu)的形成。這些結(jié)果表明，DSS 通過調(diào)節(jié)細胞骨架排列和降低 MIEN1 來損害內(nèi)皮血管生成。

圖 2    MIEN1是剪切應力調(diào)節(jié)血管生成所必需的。

實驗探索了響應 LSS 和 DSS 的細胞質(zhì)信號通路的改變，通過熱圖對響應不同剪切應力的細胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導相關基因進行聚類，發(fā)現(xiàn)與 LSS 相比，DSS 誘導的 HUVECs 中 MAPK 信號的降低最為顯著，且 p-ERK、p-MEK 和 p-p38 的表達顯著降低。然后，使用選擇性 ERK 抑制劑 SCH772984 研究了 ERK/MAPK 信號在 HUVECs 血管生成中的參與。結(jié)果表明，SCH772984 有效地降低了 p-ERK 的表達。在靜態(tài)和流動條件下，SCH772984 處理使血管生成能力明顯減弱。這些發(fā)現(xiàn)表明，剪切應力介導的 ERK/MAPK 信號積極參與血管生成，DSS 通過下調(diào) ERK/MAPK 信號阻礙內(nèi)皮血管生成。

此外，實驗發(fā)現(xiàn) p-ERK 在細胞中廣泛分布，特別是在 HUVECs 的細胞核中。有趣的是，與靜態(tài)組和 DSS 組相比，LSS 組表現(xiàn)出更高的 p-ERK 核分布（圖3 a）。熒光定量顯示，LSS 組中 p-ERK 的核積累增加，DSS 組中的核積累減少（圖3 b）。與靜態(tài)條件相比，LSS 下 HUVECs 中 p-ERK 的總水平顯著增加 193.2%，然而，當將 DSS 組與 LSS 組進行比較時，這一水平下降到 55.5%（圖3 c）。研究人員發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SS 通過細胞膜上的 MIEN1 誘導細胞質(zhì)信號傳導。si-MIEN1 可有效抑制 p-ERK 表達（圖3 d、e），而在 si-MIEN1 HUVECs 中ERK 沒有變化（圖3 d、f）。免疫熒光染色進一步證實，敲低 MIEN1 可降低 HUVECs 中的 p-ERK 表達（圖3 g、h）。這些結(jié)果表明，MIEN1 觸發(fā)內(nèi)皮血管生成中的ERK/MAPK信號。

圖3    MIEN1在內(nèi)皮血管生成中觸發(fā)ERK/MAPK信號。

圖4     示意圖闡明了DSS通過抑制MIEN1-ERK/MAPK信號軸損害HUVECs的血管生成。直動脈暴露于層流（LSS），而在分支或彎曲血管中，血流受到干擾（DSS）。血液流動中的ECs經(jīng)歷機械感應和細胞質(zhì)信號變化（ERK/MAPK信號），改變VEGFB表達，從而影響血管生成。DSS 相對于 LSS 會破壞血管生成。

總之，在這項工作中，研究人員提供了強有力的證據(jù)，證明血管生成受到不同剪切應力模式的顯著影響。血流流動中的 ECs 通過 MIEN1 和細胞骨架重塑進行機械傳感，導致細胞質(zhì)信號激活（ERK/MAPK信號），從而改變 VEGFB 的表達，調(diào)節(jié)血管生成。這些發(fā)現(xiàn)為響應剪切應力的血管生成的細胞生物物理變化提供了寶貴的見解。

參考文獻：Cheng L, Shi H, Du L, Liu Q, Yue H, Zhang H, Liu X, Xie J, Shen Y. Hemodynamic force dictates endothelial angiogenesis through MIEN1-ERK/MAPK-signaling axis. J Cell Physiol. 2024 Jan 12. doi: 10.1002/jcp.31177. Epub ahead of print. PMID: 38214132.

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