椎間盤疾病（IVDD）是脊柱退行性疾病之一。由于長(zhǎng)時(shí)間站立和肥胖導(dǎo)致的椎間盤（IVD）機(jī)械超負(fù)荷已被廣泛認(rèn)為是 IVDD 的重要原因，而髓核（NP）承擔(dān)了 75% 的壓力。然而，機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo) IVDD 的具體機(jī)制尚未闡明。

谷胱甘肽過(guò)氧化酶4（GPX4）是主要的脂質(zhì)過(guò)氧化物清除劑，在鐵死亡中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。據(jù)報(bào)道，由機(jī)械超負(fù)荷激活的 Piezo1 離子通道導(dǎo)致的鈣內(nèi)流增強(qiáng)誘導(dǎo) GPX4-調(diào)控的鐵死亡。已發(fā)現(xiàn)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（ER）的 Piezo1 的激活通過(guò)誘導(dǎo)ER的鈣離子釋放來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣。然而，機(jī)械超負(fù)荷是否會(huì)同時(shí)激活位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的 Piezo1 離子通道以升高 NP  細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+ 的水平，從而導(dǎo)致 GPX4 調(diào)控的鐵死亡仍有待確定。

硒蛋白K（SelK）是一種ER蛋白，已被證明與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞抗氧化性有關(guān)。硒（Selenium）是一種必需的微量營(yíng)養(yǎng)素，參與了抗氧化應(yīng)激的保護(hù)。補(bǔ)充硒可以上調(diào)各種硒蛋白的表達(dá)，并且在濾泡輔助性T細(xì)胞中證明了 Selenium-GPX4 軸對(duì)鐵死亡的保護(hù)作用。然而，目前還沒(méi)有關(guān)于補(bǔ)硒是否可以通過(guò)上調(diào) NP 細(xì)胞中的 SelK 和 GPX4 來(lái)減輕鐵死亡的報(bào)道。

最近，在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院骨科、病理科及美國(guó)布萊根婦女醫(yī)院骨科的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，計(jì)劃探索機(jī)械超負(fù)荷是否通過(guò)激活位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的 Piezo1 離子通道來(lái)阻礙 GPX4 的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致 NP 細(xì)胞中的鐵死亡。在上述過(guò)程中，研究員將確定促進(jìn) ER 應(yīng)激的因素以及ER應(yīng)激在鐵死亡中的具體作用，此外，將驗(yàn)證補(bǔ)充硒是否可以通過(guò)上調(diào) GPX4 和 SelK 來(lái)減輕機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的 NP 細(xì)胞鐵死亡。研究成果發(fā)表在 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊題為“Selenium-SelK-GPX4 axis protects nucleus pulposus cells against mechanical overloading-induced ferroptosis and attenuates senescence of intervertebral disc"。

首先，為了研究 IVDD 期間 NP 組織中鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的變化，評(píng)估了退變椎間盤的 Pfirrmann 分級(jí)（圖1 A）。與早期階段相比，晚期退行性椎間盤的 NP 組織體積wei縮，彈性下降（圖1 B）。在退行性 NP 組織（IV級(jí)）中，GPX4 表達(dá)水平降低，但鐵死亡生物標(biāo)志物 ACSL4 的表達(dá)水平升高（圖1 B）。

為了驗(yàn)證 NP 中過(guò)度機(jī)械負(fù)荷與鐵死亡之間的關(guān)系，將大鼠 NP 細(xì)胞在 1 Hz、1 MPa 機(jī)械應(yīng)力下培養(yǎng) 1 h。微陣列結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在機(jī)械應(yīng)力刺激下，NP 細(xì)胞中 ECM 代謝紊亂，ACSL4 水平增加（圖1 C）。GO分析顯示，差異表達(dá)蛋白與細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)和對(duì)ER應(yīng)激的反應(yīng)高度相關(guān)，ER 成為zui顯著富集的細(xì)胞成分之一（圖1 D）。對(duì) ER 應(yīng)激生物標(biāo)志物 ATF6 進(jìn)行 IHC，發(fā)現(xiàn)與 II 級(jí)相比，IV 級(jí) NP 組織中 ATF6 顯著增加（圖1 E）。

此外，通過(guò) TEM 研究了機(jī)械刺激對(duì) NP 細(xì)胞的影響。與對(duì)照組相比，在機(jī)械超負(fù)荷組 ER 在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出異常腫脹，線粒體表現(xiàn)出線粒體膜增厚和線粒體wei縮等鐵死亡相關(guān)變化（圖1 G）。然后，Western blotting 和 qPCR 證實(shí)機(jī)械刺激降低了GPX4水平，增加了 ACSL4 水平和 ER 應(yīng)激標(biāo)志物 Bip 水平（圖1 H、I）。通過(guò) GPX4 條件敲除小鼠證明了內(nèi)源性 GPX4 在 IVD 中的生理作用（圖1 J）。

這些數(shù)據(jù)表明，過(guò)度的機(jī)械負(fù)荷會(huì)誘導(dǎo) NP 細(xì)胞的鐵死亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

圖1     過(guò)度的機(jī)械負(fù)荷會(huì)誘導(dǎo)NP細(xì)胞的鐵死亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

接下來(lái)，實(shí)驗(yàn)使用 SiPiezo1 和無(wú)鈣培養(yǎng)基來(lái)研究鐵死亡、ER 應(yīng)激和機(jī)械超負(fù)荷之間的關(guān)聯(lián)（圖2 A、B）。有趣的是，清除細(xì)胞外 Ca2+ 減輕了由機(jī)械刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平的升高，而 Piezo1 的敲低具有更強(qiáng)的作用（圖2 C）。另一方面，Calnexin 水平與細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平成反比，這表明過(guò)度的機(jī)械負(fù)荷通過(guò) Piezo1 增加了細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平（圖2 C-F）。同樣，Piezo1 的敲低減少了由機(jī)械刺激的 Bip 的上升，這種效果比僅清除細(xì)胞外 Ca2+ 要顯著（圖2 D-F）。

機(jī)械超負(fù)荷增加了 NP 細(xì)胞中 ROS 的產(chǎn)生并損害了線粒體的膜電位，同時(shí)敲低 Piezo1 并清除了細(xì)胞外 Ca2+ 逆轉(zhuǎn)了這些變化，但前者更有效（圖2 G-J）。敲低 Piezo1 上調(diào)了機(jī)械刺激誘導(dǎo)的 Col-2 水平的下降，而清除細(xì)胞外 Ca2+ 作用較弱（圖2 D-F）。

此外，建立 Piezo1-CKO 小鼠闡明 Piezo1 在 ER 應(yīng)激中的作用。ATF6 免疫組化結(jié)果顯示，老齡 Piezo1-CKO 小鼠尾椎椎間盤 ER 應(yīng)激水平顯著低于老齡 WT 小鼠（圖2 K、K）。在 Piezo1 被 SiPiezo1 敲低后，細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平的升高被顯著逆轉(zhuǎn)，表明 Piezo1 的作用。

這些數(shù)據(jù)表明，機(jī)械超負(fù)荷通過(guò)位于 NP 細(xì)胞質(zhì)膜和 ER 膜上的 Piezo1 離子通道來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平以誘導(dǎo) ER 應(yīng)激和鐵死亡。

據(jù)報(bào)道，抑制ER應(yīng)激可以減輕結(jié)腸上皮細(xì)胞的鐵死亡，研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+ 可能是 ER 應(yīng)激和鐵死亡之間的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。因此，利用 Ca2+-free 培養(yǎng)基和 ER 應(yīng)激抑制劑 Bip 誘導(dǎo)因子X(jué) （BIX）進(jìn)一步探討了 ER 應(yīng)激、鐵死亡與細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+ 之間的關(guān)聯(lián)。數(shù)據(jù)顯示，BIX 上調(diào)了 Bip 的水平，從而改善了 ER 應(yīng)激并進(jìn)一步降低了 ER 應(yīng)激生物標(biāo)志物 PERK 的水平，且細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+ 的水平也降低。相應(yīng)地，觀察到 Calnexin 水平與細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+ 成反比，ACSL4 與之呈正比，GPX4 與之呈反比。此外，抑制ER應(yīng)激進(jìn)一步降低了 ROS 合成的升高，緩解了線粒體功能障礙，減少 ECM 分解代謝生物標(biāo)志物 MMP-13 的產(chǎn)生，并促進(jìn) ECM 合成代謝生物標(biāo)志物 Col-2 的分泌。這些數(shù)據(jù)表明，抑制ER應(yīng)激通過(guò)減輕從 ER 流出的 Ca2+ 來(lái)減弱機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的鐵死亡。

圖2    機(jī)械超負(fù)荷通過(guò)位于 NP 細(xì)胞質(zhì)膜和 ER 膜上的 Piezo1 離子通道來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平以誘導(dǎo) ER 應(yīng)激和鐵死亡。

進(jìn)一步的，實(shí)驗(yàn)收集了不同等級(jí)的人類 NP 組織，并檢測(cè)了selenium 的濃度，發(fā)現(xiàn)退行性 NP 組織（IV級(jí)）中其濃度降低（圖3 A）。此外，在 500 kPa 或 1 MPa 的機(jī)械應(yīng)力下培養(yǎng)大鼠 NP 細(xì)胞，無(wú)論是否添加 Se-Met，高應(yīng)變負(fù)荷降低了 selenium 的濃度，但補(bǔ)充 Se-Met 逆轉(zhuǎn)了這種變化（圖3 B）。補(bǔ)充 Se-Met 還改善了 ECM 代謝紊亂，促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)鈣離子和 ER 應(yīng)激的反應(yīng)（圖3 C、D），并改善機(jī)械超負(fù)荷引起的 ER 腫脹和線粒體wei縮（圖3 E）。qPCR 和 Western blotting 顯示，高應(yīng)變負(fù)荷降低了 GPX4 mRNA 和蛋白水平，而補(bǔ)充 Se-Met 促進(jìn)了 GPX4 的表達(dá)（圖3 F、G）。Se-Met 還改善了機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的 ROS 合成升高和線粒體功能障礙，并促進(jìn) Col-2 的表達(dá)，但當(dāng)額外應(yīng)用 GPX4 抑制劑 ML210 時(shí)，無(wú)法再觀察到這種現(xiàn)象（圖3 H、I、J）。Se-Met 還可減少 ADAMTS-5 和 MMP-13 的產(chǎn)生，促進(jìn) Aggrecan 和 Col-2 的分泌，而 ML210 則加重了 ECM 代謝紊亂（圖3 K-M）。這些數(shù)據(jù)表明，補(bǔ)充 Selenium 通過(guò)增強(qiáng) GPX4 表達(dá)來(lái)保護(hù) NP 細(xì)胞免受鐵死亡的影響。

為了探索 SelK 在機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的 ER 應(yīng)激中的作用，在大鼠 NP 細(xì)胞中敲低 SelK，添加 Se-Met，并對(duì) NP 細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械超負(fù)荷刺激。qPCR 和 Western blotting 顯示，補(bǔ)充 Se-Met 組的 SelK 表達(dá)上調(diào)，ATF6 和 PERK 降低，而補(bǔ)充 Se-Met 的 SelK 敲低組則沒(méi)有出現(xiàn)這些結(jié)果。Se-Met 組的 GPX4 表達(dá)最高，ROS 合成減少，線粒體功能障礙得到改善，而 SelK 敲低后效果消失。此外，補(bǔ)充 Se-Met 可減少 ADAMTS-5 和 MMP-13 的產(chǎn)生，促進(jìn) Aggrecan 和 Col-2 的分泌，而敲低 SelK 會(huì)加重 ECM 代謝紊亂。這些數(shù)據(jù)表明，補(bǔ)充 Selenium 通過(guò)上調(diào) SELK 表達(dá)來(lái)減輕 ER 應(yīng)激。

圖3    補(bǔ)充Selenium通過(guò)增強(qiáng) GPX4 表達(dá)來(lái)保護(hù) NP 細(xì)胞免受鐵死亡的影響。

最后，使用 WT 和 GPX4-CKO 小鼠來(lái)驗(yàn)證 Selenium 在體內(nèi)的作用，在12周齡的 WT 和 GPX4-CKO 小鼠中建立 IVDD 模型（圖4 A、B），收集小鼠的尾骨椎間盤組織，檢測(cè)  Selenium 的濃度。有趣的是，針刺降低了 Selenium 的濃度，但補(bǔ)充 Se-Met 改善了這種變化，但這種效果在 GPX4-CKO 小鼠中減弱（圖4 C）。MRI和顯微CT顯示，Se-Met 可緩解 WT 小鼠針刺誘導(dǎo)的 IVDD，然而，通過(guò)補(bǔ)充 Selenium，GPX4-CKO 小鼠的 IVDD 表型并未得到改善（圖4 D、E）。免疫組化染色顯示，補(bǔ)充 Se-Met 的 WT 和 GPX4-CKO 小鼠中 SelK 表達(dá)增加，ATF6 降低（圖4 F、G）。此外，在補(bǔ)充 Se-Met 的 WT 小鼠中觀察到 Col-2 的表達(dá)增加和 MMP-13 的表達(dá)降低，但在 GPX4-CKO 小鼠中沒(méi)有觀察到（圖4 F、G），這提示 GPX4 是 Se-Met 起作用的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。這些數(shù)據(jù)表明，補(bǔ)充 Selenium 可緩解小鼠 IVDD 的進(jìn)展。

圖4     補(bǔ)充硒可減輕小鼠IVDD的進(jìn)展。

圖5    Selenium-SelK-GPX4 軸保護(hù)髓核細(xì)胞免受機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的鐵死亡的示意圖。

綜上所述，該研究表明，在 NP 細(xì)胞中，當(dāng)位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的 Piezo1 離子通道被機(jī)械超負(fù)荷激活時(shí)，細(xì)胞外鈣內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)鈣外流加強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而導(dǎo)致 ER 應(yīng)激，進(jìn)一步加劇 ER 鈣外流，進(jìn)而阻礙 GPX4 的產(chǎn)生和功能，誘導(dǎo)鐵死亡和 ECM 代謝紊亂。然而，補(bǔ)充 Selenium 可以上調(diào) SelK 表達(dá)，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增強(qiáng) GPX4 表達(dá)，減弱細(xì)胞氧化應(yīng)激和鐵死亡?？傊?，鐵死亡在機(jī)械超負(fù)荷誘導(dǎo)的 IVDD 中起重要作用，補(bǔ)充 Selenium 對(duì)減輕鐵死亡，從而緩解 IVDD 具有重要意義，這可能為 IVDD 的潛在治療干預(yù)提供見(jiàn)解。

參考文獻(xiàn)：Jia C, Xiang Z, Zhang P, Liu L, Zhu X, Yu R, Liu Z, Wang S, Liu K, Wang Z, Vasilev K, Zhou S, Geng Z, Liu X, Zhao Y, Gao Y, Cheng L, Li Y. Selenium-SelK-GPX4 axis protects nucleus pulposus cells against mechanical overloading-induced ferroptosis and attenuates senescence of intervertebral disc. Cell Mol Life Sci. 2024 Jan 22;81(1)49. doi 10.1007s00018-023-05067-1. PMID 38252317; PMCID PMC10803455.

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