血流動力學(xué)因素在動脈粥樣硬化、血栓形成和動脈瘤等血管疾病的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。其中，擾動剪切應(yīng)力（SS）被認(rèn)為是血管疾病發(fā)生和進(jìn)展的主要生物力學(xué)因素之一。除了生物力學(xué)外，包括轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）/骨/體形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號軸的生長因子在內(nèi)的擾動生化信號已被證明可以調(diào)節(jié)ECs 在EndoMT 中的轉(zhuǎn)變。因此，受干擾的TGFβ/BMP信號和生物力學(xué)的結(jié)合有助于動脈粥樣硬化和EC炎癥的發(fā)病機(jī)制。

BMP9/10 是可溶性配體，在血流中循環(huán)作用于內(nèi)皮細(xì)胞。它們通過與高親和力I型受體活化素樣激酶1（ALK1）和II型受體結(jié)合，并在共受體Enoglin的促進(jìn)下，不斷為EC提供存活和靜止信號。通過典型的SMAD1/5轉(zhuǎn)錄因子信號調(diào)節(jié)靶基因是環(huán)境依賴性的，因?yàn)锽MP9單獨(dú)調(diào)節(jié)分化抑制劑（ID）基因的表達(dá)，或與其他因子（如TNF-α）、SELE或EDN1的表達(dá)聯(lián)合使用。BMP信號失調(diào)驅(qū)動EC增殖、去分化和炎癥基因特征?？箘用}粥樣硬化性高 SS 與致動脈粥樣硬化性低 SS 如何整合到 ALK1-Endoglin-SMAD1/5 信號軸的調(diào)節(jié)中，人們知之甚少。

BMP受體內(nèi)吞作用通過不同的途徑發(fā)生。網(wǎng)格蛋白（Clathrin）介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）誘導(dǎo)SMAD信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而小窩蛋白（Caveolin）介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CvME）導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)終止和受體降解。有研究提出了另一種模型，即在TGFβ I型受體的內(nèi)吞作用中，CME和CvME都內(nèi)化為早期內(nèi)體抗原1（EEA-1）陽性早期內(nèi)吞體（EEs）。重要的是，這些EEs是TGFβ-SMAD2/3信號的調(diào)控?zé)狳c(diǎn)。

基于此，德國柏林自由大學(xué)生化研究所實(shí)驗(yàn)室及德國心血管研究中心（DZHK）科研團(tuán)隊的一項研究曾發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化保護(hù)性 HSS 可防止ALK1 和 Endoglin 在 Caveolin-1 陽性 EEs 中的積累，而致動脈粥樣硬化LSS 則相反，實(shí)驗(yàn)確定它們是啟動動脈粥樣硬化性SMAD1/5信號傳導(dǎo)的信號熱點(diǎn)。此外，通過 siRNA 介導(dǎo)的敲低 Caveolin-1 導(dǎo)致 SMAD1/5 激活降低，這為如何在血管系統(tǒng)中靶向過度活躍的 BMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了一種新模式。詳細(xì)內(nèi)容發(fā)表在 BMC Biology 期刊題為“Atheroprone fluid shear stress-regulated ALK1-Endoglin-SMAD signaling originates from early endosomes"。

首先，實(shí)驗(yàn)使用RNAseq數(shù)據(jù)分析BMP受體和相關(guān)共受體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ACVRL1 在 HSS（30 dyn/cm2）下上調(diào)，而大多數(shù) BMP 和共受體在 LSS（1 dyn/cm2）下上調(diào)，包括 ALK1 共受體 Endoglin （ENG）。繼續(xù)分析 Endoglin 的蛋白質(zhì)水平，與 LSS 相比，HSS 中的 Endoglin 水平確實(shí)顯著降低。

致動脈粥樣硬化振蕩SS（OSS）可誘導(dǎo)SMAD1/5的持續(xù)激活。雖然有研究指出，與LSS相比，OSS中SMAD1/5磷酸化的長期誘導(dǎo)與BMP配體無關(guān)，但最近的研究顯示，在低血清條件下，短期層流SS介導(dǎo)的SMAD1/5磷酸化誘導(dǎo)依賴于BMP9/10。研究人員在這里表明，與HSS相比，長期（24h）應(yīng)用LSS增加了SMAD1/5的磷酸化（圖1 A）。因此，LSS 中的 BMP 靶基因轉(zhuǎn)錄高于 HSS（圖1 B）。此外，觀察到這種誘導(dǎo)依賴于ALK1配體，可能是BMP9和BMP10，因?yàn)橛?0 ng/mL ALK1-Fc（BMP9和BMP10的既定配體陷阱）處理可顯著消除這種反應(yīng)（圖1 C）。BMP靶基因ID3以及炎癥標(biāo)志物EDN1、粘附分子P-選擇素（SELP）和間充質(zhì)標(biāo)志物CDH2、ADAM12、NEXN和EndoMT介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子SLUG的表達(dá)在暴露于LSS并用ALK1-Fc處理的HUVECs中降低（圖1 D）。值得注意的是，應(yīng)用ALK1-Fc后，HSS中靜脈EC標(biāo)志物CD34和動脈粥樣硬化保護(hù)性LDLR的表達(dá)降低（圖1 D）。

這些數(shù)據(jù)表明，LSS暴露誘導(dǎo)SMAD1/5磷酸化以及隨后EDN1，特別是間質(zhì)基因的表達(dá)高度依賴于BMP9/10。然而，BMP-ALK1 信號協(xié)同 HSS 對于維持內(nèi)皮表型的重要血管保護(hù)基因的表達(dá)至關(guān)重要。此外，還發(fā)現(xiàn)炎癥和EC標(biāo)志物（分別為ACE，CDH5和TEK）受SS而非BMP信號調(diào)節(jié)。這說明了BMP信號整合到SS介導(dǎo)的一組特定且重要的靶基因的轉(zhuǎn)錄變化中。

圖1 HSS 和 LSS 對 ALK1 介導(dǎo)的 BMP 信號的不同影響。

先前的一項研究表明，在FSS下，Endoglin只需要促進(jìn)BMP9 誘導(dǎo)的磷酸化-Smad1/5 信號，為了擴(kuò)展這一研究，實(shí)驗(yàn)接下來探討了短期（30min）FSS脈沖后，在低（0.2% FCS）和高（20% FCS）血清濃度下，Endoglin在BMP-SMAD對短時間FSS反應(yīng)性中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pSMAD1/5 的急性血流誘導(dǎo)取決于施加的力的大?。℉SS > LSS） 和 Endoglin 的存在（圖2 A）。然而，當(dāng)不限制血清濃度的情況下進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)時，敲低Enoglin對SMAD1/5磷酸化沒有顯示出影響（圖2 B），這表明只有在低血清（即BMP9/10的有限濃度）存在的情況下，Enoglin 才能整合對SMAD信號的急性FSS反應(yīng)。

在存在 20% 血清和長期（24h）FSS 的情況下，發(fā)現(xiàn) Endoglin 耗竭在 LSS 和 HSS 條件下顯著增加磷酸化-SMAD1/5 水平（圖2 C）。因此，可以得出結(jié)論，雖然Endoglin 在配體缺乏的血清條件下是FSS增強(qiáng)的BMP9/10信號所必需的，但在配體飽和的情況下則是可有可無的。此外，在 FSS 適應(yīng)的 HUVECs 中，Endoglin 意外地限制了 BMP9/10-ALK1-磷酸化-SMAD1/5 的反應(yīng)。這清楚地表明，Enoglin在ALK1或其配體受限的條件下尤為重要（例如遺傳引發(fā)的ALK1或BMP9/10缺失導(dǎo)致的嚴(yán)重血管病變），而在EC適應(yīng)血流時，它似乎對磷酸化-SMAD1/5信號通路起負(fù)調(diào)控作用。分析 ID3、EDN1 和 SLUG 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它們在 HSS 和伴隨的 Endoglin 敲低條件下表達(dá)增強(qiáng)（圖2 D），表明 Endoglin 對血流適應(yīng)的 ECs 具有保護(hù)作用。

為了進(jìn)一步表征 Endoglin敲低的功能結(jié)果，對暴露于 HSS 的對照組或 Endoglin敲低組細(xì)胞進(jìn)行了白細(xì)胞粘附測定。可以證明，在 Endoglin 敲低組顯著更多的白細(xì)胞粘附在 HUVEC 單層上（圖2 E、F）。這與敲低條件下 SELP 的增強(qiáng)表達(dá)一致（圖2 G）。

然后，為了闡明 Endoglin 敲低后加劇的 SMAD1/5 磷酸化是否依賴于 BMP9/ALK1 信號傳導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)在 50 ng/mL ALK1-Fc 存在下進(jìn)行了 Endoglin 敲低實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALK1-Fc的添加有效地消除了SMAD1/5磷酸化，并將靶基因表達(dá)降低到對照水平以下（圖2 C、D）。這些數(shù)據(jù)說明，Endoglin 對于保護(hù) ECs 免于獲得動脈粥樣硬化表型是必要的，并且 Endoglin 缺失后 SMAD1/5 磷酸化的增加取決于 BMP9/10。

圖2 Endoglin 根據(jù)血清濃度調(diào)節(jié) FSS 誘導(dǎo)的 ALK1 介導(dǎo)的 BMP 信號。

目前，導(dǎo)致LSS誘導(dǎo)SMAD1/5磷酸化水平超過保護(hù)性HSS水平的分子機(jī)制仍然難以捉摸。有報道稱，ALK5（一種I型TGFβ受體）通過Caveolin-1-和Clathrin-依賴性內(nèi)吞作用被內(nèi)化，并定位于Caveolin-1陽性EEs，并且這些內(nèi)體富集了TGFβ通路的信號組分。有趣的是，ALK1 和 Endoglin 也被證明定位于 Cav-1 膜結(jié)構(gòu)域。敲低 Caveolin-1 會降低 BMP9 誘導(dǎo)的 HUVECs 中 SMAD1/5 磷酸化。因此，研究人員假設(shè) Caveolin-1 是血流誘導(dǎo)的 BMP9-Endoglin-ALK1 信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分。

然后分析了長期應(yīng)用HSS和LSS時Caveolin-1和Enoglin的分布，觀察到大量富含 Endoglin 且 Caveolin-1 呈陽性的細(xì)胞內(nèi)囊泡（圖3 A、B），且暴露于LSS時的數(shù)量比HSS更多（圖3 C）。Caveolin-1、Endoglin 和 EEA1 的共染色將這些囊泡鑒定為 EEs（圖3 D、E），且LSS 中 EEA1 陽性 Cav-1 囊泡的發(fā)生率明顯更高（圖3 F）。

最后，實(shí)驗(yàn)分析了 Caveolin-1 陽性 EEs 中是否同時存在 Endoglin 和 ALK1，并對過表達(dá)的 ALK1-GFP 與內(nèi)源性 Endoglin 進(jìn)行了鄰位連接測定（PLA），并對 Caveolin-1 進(jìn)行了共染色。結(jié)果觀察到 Caveolin-1 陽性囊泡內(nèi)的 PLA 信號，表明 ALK1-Endoglin 受體復(fù)合物位于 EE 區(qū)室中 （圖3 G、H）。此外，與 Caveolin-1 共染色顯示 Caveolin-1 囊泡中存在 SiR 標(biāo)記的 BMP9（圖3 I）。這清楚地表明，活躍的配體結(jié)合的受體信號復(fù)合物存在于富含Caveolin-1 的早期內(nèi)體中。

這些數(shù)據(jù)表明，Endoglin 與 ALK1 和 BMP9 一起定位于富含 Caveolin-1 的 EEs，實(shí)驗(yàn)將其確定為一種新的但未被識別的信號區(qū)室，在長期暴露于 LSS 的ECs中促進(jìn) SMAD 積累。

圖3 Caveolin-1陽性早期內(nèi)體是 FSS 誘導(dǎo)的 BMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的熱點(diǎn)。

圖4 圖形概要。在動脈粥樣硬化性LSS條件下（左），循環(huán)BMP9被在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的Endoglin隔離。Endoglin 與 II 型受體界面結(jié)合，從而阻斷 BMP I/II 型受體復(fù)合物的形成。然而，殘留的 BMP9-ALK1 型 II 受體信號發(fā)生在質(zhì)膜上。通過小窩內(nèi)化后，Endoglin 被 EEs 中的 II 型受體取代，并誘導(dǎo)加劇的 pSMAD1/5 信號傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致間充質(zhì)和動脈粥樣硬化蛋白基因的表達(dá)。在動脈粥樣硬化保護(hù)性HSS條件下（右），BMP9與ALK1和II型受體以及Endoglin結(jié)合，后者抑制BMP9 I/II型受體的形成。與 LSS 相比，Caveolin介導(dǎo)的內(nèi)吞作用顯著減少，殘留的 pSMAD1/5 信號來自質(zhì)膜而不是 CAV1 EE。最終，HSS 導(dǎo)致負(fù)責(zé) EC 存活和靜止的基因的表達(dá)。

總之，該研究表明 Endoglin 對于限制 BMP9/10 誘導(dǎo)的 SMAD1/5 磷酸化水平是必要的，該磷酸化可保護(hù) FSS 暴露的 ECs 免受炎癥標(biāo)志物 EDN1 的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn) Endoglin 定位于 Caveolin-1 陽性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的 EEs。這個新發(fā)現(xiàn)的 EE 區(qū)室對于 LSS 誘導(dǎo)的致動脈粥樣硬化性 BMP 信號的增加至關(guān)重要。未來需要進(jìn)一步研究 BMP 信號串?dāng)_與 FSS 機(jī)械生物學(xué)，特別是考慮到異常 BMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在 HHT 和 PAH 等血管疾病中的作用。

參考文獻(xiàn)：Mendez PL, Obendorf L, Jatzlau J, Burdzinski W, Reichenbach M, Nageswaran V, Haghikia A, Stangl V, Hiepen C, Knaus P. Atheroprone fluid shear stress-regulated ALK1-Endoglin-SMAD signaling originates from early endosomes. BMC Biol. 2022 Sep 28;20(1):210. doi: 10.1186/s12915-022-01396-y. PMID: 36171573; PMCID: PMC9520843.

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