巨噬細(xì)胞是人體非常重要的免疫細(xì)胞，最主要的作用是引起機(jī)體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞的表型與功能受多種環(huán)境因素的精細(xì)調(diào)節(jié)，如溫度、pH 值和氧濃度等。研究表明，多種類型的機(jī)械應(yīng)力，包括靜水壓力、剪切應(yīng)力和拉伸力，與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)程度密切相關(guān)。例如，周期性靜水壓力（CHP） 和機(jī)械壓力促進(jìn)巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的分泌。然而，機(jī)械感覺誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的潛在機(jī)制仍未完quan清楚。

代謝重編程對巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)至關(guān)重要。促炎巨噬細(xì)胞的激活常伴隨代謝從氧化磷酸化（OXPHOS）向有氧糖酵解的轉(zhuǎn)化，類似于腫瘤中的 Warburg 效應(yīng)。糖酵解是一種將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸的代謝途徑，受各種糖酵解酶的控制。有氧糖酵解盡管是一種低效產(chǎn)生ATP的過程，但其通過快速提供分子合成的代謝中間體來支持活化巨噬細(xì)胞的能量和營養(yǎng)需求。環(huán)境信號可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的代謝重編程，然而，物理刺激對巨噬細(xì)胞代謝狀態(tài)的影響尚不清楚。一些研究報(bào)告稱，Piezo1介導(dǎo)的Ca2+ 信號在巨噬細(xì)胞中可促進(jìn)細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和延長促炎表達(dá)譜。考慮到代謝狀態(tài)與免疫反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)，Piezo1激活可能有助于巨噬細(xì)胞的代謝重編程，但是，這尚未有報(bào)道。

基于此，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院血液科、山東省血液免疫學(xué)省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的課題組在一項(xiàng)研究中旨在探討機(jī)械力是否通過機(jī)械控陽離子通道 Piezo1 的激活來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的代謝狀態(tài)從而影響炎癥的發(fā)生發(fā)展。研究表明，Piezo1介導(dǎo)的機(jī)械感覺誘導(dǎo)代謝轉(zhuǎn)向有氧糖酵解，并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。具體內(nèi)容發(fā)表在 Frontiers in Immunology 期刊題為“Ion channel Piezo1 activation promotes aerobic glycolysis in macrophages"。

首先，實(shí)驗(yàn)檢查了BMDMs中幾個(gè)機(jī)械敏感通道的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)無論是靜息狀態(tài)，還是化學(xué)信號（LPS，脂多糖）和機(jī)械力刺激（CHP，45 mmHg-60 mmHg）下，Piezo1在BMDMs中高表達(dá)。通過構(gòu)建髓系細(xì)胞特異性敲除 Piezo1 轉(zhuǎn)基因小鼠Lyz2cre/+ Piezo1flox/flox，證明了巨噬細(xì)胞上Piezo1 的激活促進(jìn) LPS 誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)和分泌。

為了確定 Piezo1 敲除誘導(dǎo)的促炎譜改變的機(jī)制，分析了 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Piezo1敲除細(xì)胞中下調(diào)的基因顯著參與了碳代謝的生物學(xué)過程，提示了Piezo1在葡萄糖代謝中的作用。此外，糖酵解相關(guān)基因（Alodoa、Pkm、Eno1、Gapdh、Ldha 和 Gpi1）在 Piezo1 敲除髓系細(xì)胞中表達(dá)降低（圖1 A-C）。然后進(jìn)行 XF 糖酵解速率測定，以驗(yàn)證 Piezo1 敲除巨噬細(xì)胞的糖酵解變化。結(jié)果顯示，當(dāng) Piezo1 完quan敲除時(shí)，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)從有氧糖酵解向 OXPHOS 的代謝重編程（圖1 D、E）。

此外，對LPS處理的BMDMs進(jìn)行糖酵解速率分析以研究Piezo1對LPS誘導(dǎo)的代謝重塑的影響，發(fā)現(xiàn)LPS刺激顯著提高了BMDMs的糖酵解速率。LPS刺激下Piezo1敲除的BMDMs的基礎(chǔ)糖酵解、補(bǔ)償性糖酵解和加入2-DG（2-脫氧葡萄糖）后酸化明顯低于LPS刺激的對照BMDMs（圖1 F、G），而 LPS 刺激的 Piezo1 敲除 BMDMs 的 mitoOCR/基礎(chǔ) PER 比值更高（圖1 H）。這一結(jié)果表明，Piezo1缺失破壞了LPS誘導(dǎo)的代謝重編程。此外，2-DG 抑制了BMDMs 中 IL-6 和 TNF-α 的分泌，表明 Piezo1 介導(dǎo)的代謝重編程會影響巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答（圖1 I）。

由于Piezo1是由外部機(jī)械信號激活的，因此使用代謝組學(xué)進(jìn)一步分析了有或沒有CHP處理的BMDMs中葡萄糖代謝關(guān)鍵產(chǎn)物的變化。結(jié)果顯示，CHP顯著增加糖酵解多種中間產(chǎn)物的含量，表明糖代謝增強(qiáng)（圖1 J）。在CHP刺激下，Piezo1缺失BMDMs中的幾種糖酵解產(chǎn)物顯著減少，可以直接提示糖酵解通路受抑。與Piezo1缺失BMDMs相比，玻珀酸和檸檬酸在CHP處理后野生型BMDMs中表現(xiàn)出更高的積累水平，而富馬酸和蘋果酸在兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明Piezo1是CHP誘導(dǎo)的TCA（三羧酸循環(huán)）循環(huán)所必需的（圖1 K）。

圖1 Piezo1對巨噬細(xì)胞中的糖酵解重編程至關(guān)重要。

Yoda1 是一種特異性 Piezo1 通道激動劑。為了確定 Yoda1 是否參與葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)，接下來測定了有或沒有 Yoda1 預(yù)處理的 BMDMs的糖酵解通量。結(jié)果顯示，Yoda1預(yù)處理增加了BMDMs的糖酵解通量。LPS刺激顯著提高了糖酵解能力，Yoda1進(jìn)一步增強(qiáng)了這一作用。此外，在 IL-4 刺激下，BMDMs 中的 mitoOCR/基礎(chǔ) PER 比率顯著增加，反映了替代激活巨噬細(xì)胞向 OXPHOS 的代謝轉(zhuǎn)化，但被 Yoda1 處理逆轉(zhuǎn)。為了驗(yàn)證 Yoda1 誘導(dǎo)的代謝調(diào)節(jié)依賴于 Piezo1 離子通道，用 Yoda1 預(yù)處理的正常或 Piezo1敲除 BMDMs 的糖酵解率，顯示Piezo1 敲除降低了 Yoda1 對 BMDMs 糖酵解的促進(jìn)作用，表明 Yoda1 介導(dǎo)的代謝調(diào)控是 Piezo1 依賴性的。

從機(jī)制上講，Piezo1介導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+ 內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 超載，從而增加鈣依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活。因此，使用無鈣培養(yǎng)基來消耗細(xì)胞外鈣離子以評估 Yoda1 處理的 BMDMs 中糖酵解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。Yoda1 可促進(jìn) Glut1、Pkm 和 Ldha 的糖酵解關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄，但鈣消耗顯著抑制了這些效應(yīng)（圖2 A）。此外，KN93 （競爭性鈣調(diào)蛋白依賴性激酶2型抑制劑）降低了 Yoda1 誘導(dǎo)的糖酵解水平升高（圖2 B）。這說明，Piezo1對于巨噬細(xì)胞內(nèi)糖酵解水平的調(diào)節(jié)依賴于鈣依賴信號通路的活化。

HIF1α 是調(diào)節(jié)多種糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，因此，對HIF1α進(jìn)行了免疫熒光分析，顯示Piezo1敲除降低了LPS誘導(dǎo)的HIF1α表達(dá)和核轉(zhuǎn)位（圖2 C）。此外，HIF1α 及其共激活因子 P300 的蛋白水平在 Piezo1 敲除BMDMs 中降低（圖2 D）。核內(nèi)的 HIF1α 蛋白水平也降低（圖2 E）。

據(jù)報(bào)道，CaMKII 激活可由 Piezo1 激活誘導(dǎo)，參與維持 HIF1α 的穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS刺激或CHP顯著促進(jìn)正常細(xì)胞中的CaMKII磷酸化，而Piezo1敲除通過干擾鈣穩(wěn)態(tài)來降低CaMKII磷酸化。KN93 的施用抑制了 CaMKII 的磷酸化以及 LPS 或 CHP 誘導(dǎo)的野生型巨噬細(xì)胞中 HIF1α 的穩(wěn)定和 P300 的表達(dá)（圖2 D）。此外，HIF1α 的下調(diào)消除了正常BMDMs和Piezo1敲除BMDMs之間糖酵解的差異（圖2 F）。同樣，KN93也減弱了Piezo1敲除引起的代謝差異（圖2 G）。這些結(jié)果表明，Ca2+-CaMKII-HIF1α 信號通路參與了 Piezo1 誘導(dǎo)的代謝重編程。

圖2 Piezo1通過Ca2+-CaMKII-HIF1α軸促進(jìn)巨噬細(xì)胞的代謝開關(guān)。

腸道炎癥伴有機(jī)械力的變化，包括腸腔內(nèi)壓、結(jié)腸血流量和基質(zhì)硬度的增加。葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎是一種自限性疾病，受巨噬細(xì)胞啟動的先天免疫應(yīng)答高度調(diào)節(jié)。最后，實(shí)驗(yàn)旨在使用轉(zhuǎn)基因小鼠確認(rèn) Piezo1 在 DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中的體內(nèi)作用。結(jié)果顯示，Piezo1 缺失顯著改善了 DSS 誘導(dǎo)的炎癥，表現(xiàn)為體重降低的減少，腸道長度增加，組織學(xué)評分降低及炎癥因子水平降低（圖3 A-E）。此外，Piezo1敲除小鼠結(jié)腸中巨噬細(xì)胞中糖酵解相關(guān)基因的mRNA水平降低（圖3 F）。這些結(jié)果顯示，髓系Piezo1 敲除改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，且與HIF1α 的表達(dá)及糖酵解水平降低相關(guān)。

然后確定了 Yoda1 誘導(dǎo)的 Piezo1 激活是否受小鼠結(jié)腸炎進(jìn)展的影響，結(jié)果證明，在生理?xiàng)l件下，只有 Yoda1 不影響小鼠體重、結(jié)腸長度和組織學(xué)評分，但在炎癥狀態(tài)下，Yoda1加劇了疾病進(jìn)展，在DSS處理后表現(xiàn)為體重減輕、結(jié)腸長度更短及組織學(xué)評分的增加（圖3 G-I）。組織學(xué)染色和免疫熒光顯示，Yoda1促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤（圖3 J），還導(dǎo)致 IL-6、TNF-α 和 IL-1β 水平升高（圖3 K），以及結(jié)腸巨噬細(xì)胞中 Glut1 和Ldha mRNA 水平升高（圖3 L）。這說明，外源 Yoda1 加劇小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的進(jìn)展。

圖3 Piezo1缺乏可改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎。

總之，該研究表明機(jī)械敏感離子通道蛋白 Piezo1 通過 Ca2+-CaMKII-HIF1α 軸調(diào)控巨噬細(xì)胞有氧糖酵解，并促進(jìn)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)展中具有重要作用。機(jī)械力改變是急慢性炎癥中一個(gè)重要的環(huán)境特征，并可能同時(shí)重塑免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。該研究結(jié)果證明了機(jī)械刺激誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的代謝重編程，也為外源環(huán)境因素調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)提供了新的見解。

參考文獻(xiàn)：Leng S, Zhang X, Wang S, Qin J, Liu Q, Liu A, Sheng Z, Feng Q, Hu X, Peng J. Ion channel Piezo1 activation promotes aerobic glycolysis in macrophages. Front Immunol. 2022 Sep 2;13:976482. doi: 10.3389/fimmu.2022.976482. PMID: 36119083; PMCID: PMC9479104.

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