乳腺腫瘤細(xì)胞從原發(fā)性部位的親本細(xì)胞擴(kuò)散為異質(zhì)性細(xì)胞群，如轉(zhuǎn)移性腫瘤。異質(zhì)性進(jìn)展是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，涵蓋了腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的整個臨床史，由腫瘤細(xì)胞和旁觀者細(xì)胞（bystander cell）之間的相互作用所驅(qū)動。腫瘤微環(huán)境的各種固有細(xì)胞（resident cell）類型都與此有關(guān)。例如：造血譜系的細(xì)胞在此過程中起著驅(qū)動作用；骨髓造血干細(xì)胞生態(tài)位是異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞存活和定植的適宜空間。另一種重要的旁觀者細(xì)胞類型，即間充質(zhì)干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞（MSCs），可能被吸引到腫瘤微環(huán)境中成為腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞，通過影響腫瘤細(xì)胞存活、治療耐藥性、血管生成和免疫逃逸來促進(jìn)異質(zhì)性進(jìn)展。最重要的是，骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）通過促進(jìn)異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞定植和增殖來調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)移。由于腫瘤異質(zhì)性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移涉及與多種旁觀者固有細(xì)胞類型的相互作用，因此需要合適的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠砥饰鋈橄侔┻M(jìn)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

目前的研究使用各種共培養(yǎng)模型來研究腫瘤和間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)過程中，腫瘤細(xì)胞與旁觀者細(xì)胞融合可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性。這些結(jié)果表明，腫瘤微環(huán)境中的旁觀者細(xì)胞在異質(zhì)性進(jìn)展中起著決定性作用，并且與BM-MSCs的相互作用是腫瘤細(xì)胞獲得骨轉(zhuǎn)移潛力的直接途徑。

在美國西達(dá)賽奈醫(yī)療中心（Cedars-Sinai Medical Center）團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，課題人員研究了另一個浸潤腫瘤微環(huán)境的重要旁觀者細(xì)胞群——造血細(xì)胞（HCs），是否可以與腫瘤細(xì)胞相互作用以促進(jìn)異質(zhì)性進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)用紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記的人乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞首先與 HCs共培養(yǎng)，然后與 BM-MSCs 共培養(yǎng)，通過腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定的形態(tài)學(xué)、行為和蛋白質(zhì)表達(dá)變化證實(shí)了旁觀者細(xì)胞在腫瘤異質(zhì)性進(jìn)展中的作用。具體研究內(nèi)容發(fā)表在 CELLS 期刊題為“Breast Cancer MCF-7 Cells Acquire Heterogeneity during Successive Co-Culture with Hematopoietic and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells"。

造血譜系的細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中旁觀者細(xì)胞的重要組成部分，因?yàn)楦鞣N類型的 HCs都是腫瘤浸潤細(xì)胞并顯示出轉(zhuǎn)移趨向性。研究人員通過進(jìn)行一系列的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，選擇了具有代表性的紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記的克隆RMCF7-2用于后續(xù)研究。

首先，通過將不同類型（健康供體和乳腺癌患者的PBMCs）的 HCs 與RMCF7-2 細(xì)胞單層進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與不同HCs共培養(yǎng)均可導(dǎo)致RMCF7-2 細(xì)胞的形態(tài)和行為變化。例如，在與乳腺癌患者的PBMCs共培養(yǎng)中，單層中的單個RMCF7-2細(xì)胞在第一周內(nèi)會收縮，彼此失去接觸，同時出現(xiàn)懸浮的大而圓的紅色熒光細(xì)胞。第二周，附著的RMCF7-2細(xì)胞數(shù)量減少，大部分細(xì)胞脫離，采用懸浮生長（圖1）。這說明，上皮細(xì)胞RMCF7-2與HCs共培養(yǎng)后采取懸浮生長的模式。

細(xì)胞間接觸的喪失似乎是一種先天或程序性的反應(yīng)，因?yàn)樵赗MCF7-2細(xì)胞與所有11種人類和6種小鼠HCs 共培養(yǎng)中也觀察到相同的反應(yīng)。這一系列的共培養(yǎng)物表明，無論使用哪種類型的HCs，RMCF7-2細(xì)胞都會以相似的形態(tài)和行為變化做出反應(yīng)。由此可見，直接接觸存活的HCs能夠誘導(dǎo)RMCF7-2細(xì)胞改變形態(tài)和生長行為。

圖1 RMCF7-2 與 HCs 共培養(yǎng)過程中的形態(tài)和生長行為。

為了評估觀察到的變化是短暫的還是yong久性的，使用 G418（300 μg/mL）處理共培養(yǎng)物清除剩余的 HCs，留下懸浮的紅色熒光細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)來自共培養(yǎng)物的紅色熒光細(xì)胞在第 15 次傳代后仍保持增殖，表明獲得性懸浮生長是一種穩(wěn)定的表型。然后建立了用于詳細(xì)分析的克隆細(xì)胞（MAF-2 和MAF-12）（圖2），進(jìn)行持續(xù)的傳代以進(jìn)一步評估克隆細(xì)胞在懸浮生長中的穩(wěn)定性。盡管這些懸浮的衍生克隆的生長速度通常比親本RMCF7-2細(xì)胞慢，但都沒有失去懸浮生長的跡象。因此，HC樣形態(tài)和懸浮液生長的獲得特征是相當(dāng)穩(wěn)定的。

接下來，為了描述伴隨形態(tài)和行為轉(zhuǎn)換的基因表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)通過MCF-7細(xì)胞標(biāo)記蛋白來檢測分離的衍生克隆細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡法鑒定實(shí)質(zhì)性的表達(dá)變化。結(jié)果觀察到，第30次傳代的 MAF-2和 MAF-12克隆表達(dá)顯著降低的 ERα。另一個突出的變化是PR表達(dá)的丟失。相比之下，盡管EGFR1水平升高，但ERβ或Her2/neu水平幾乎沒有變化。有趣的是，當(dāng)這些細(xì)胞放棄上皮形態(tài)時，大量的E-cad持續(xù)存在，盡管水平較低，而在這些細(xì)胞中未檢測到波形蛋白。從第30代到第60次傳代，表達(dá)變化持續(xù)存在。這些結(jié)果表明，穩(wěn)定的表型轉(zhuǎn)換伴隨著基因表達(dá)的穩(wěn)定變化。

圖2 將RMCF7-2與乳腺癌患者PBMCs 共培養(yǎng)分離的MAF-2和MAF-12克隆以1:5的重復(fù)比例進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。在傳代60次時拍攝細(xì)胞圖像。

乳腺癌經(jīng)常轉(zhuǎn)移到骨骼。在此過程中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞可能會與不同的旁觀者細(xì)胞（包括BM-MSCs）發(fā)生連續(xù)相互作用。因此，實(shí)驗(yàn)將克隆的 MAF-2 與 MAF-12 細(xì)胞和 hBM-MSCs 進(jìn)行了另一輪共培養(yǎng)，并監(jiān)測共培養(yǎng)中的細(xì)胞形態(tài)和生長行為。

第二輪共培養(yǎng)的觀察結(jié)果顯示，懸浮生長中的MAF-2和MAF-12細(xì)胞在基質(zhì)單層存在下恢復(fù)了附著生長。腫瘤細(xì)胞和hBM-MSCs之間經(jīng)常發(fā)生細(xì)胞融合事件（圖3A），表現(xiàn)為紅色熒光細(xì)胞，但具有hBM-MSCs形態(tài)。在第三周，紅色熒光細(xì)胞開始成群出現(xiàn)，很可能是因?yàn)榭寺U(kuò)增（圖3 B）。這些細(xì)胞呈短紡錘形，沒有細(xì)胞間接觸，分散排列或重疊生長，而一些附著生長的細(xì)胞仍然保持圓形細(xì)胞形狀（圖3 A、B）。在4 周的共培養(yǎng)結(jié)束時，hBM-MSCs 單層細(xì)胞充滿了異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞簇，代表具有不同克隆形態(tài)和生長行為的單個紅色熒光克隆。這些結(jié)果再次證明，與旁觀者細(xì)胞的相互作用改變了腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和生長行為。由于腫瘤-間充質(zhì)干細(xì)胞相互作用發(fā)生在單個細(xì)胞之間，因此這種相互作用可能會單獨(dú)影響癌細(xì)胞，從而導(dǎo)致克隆間異質(zhì)性。

圖3 與 hBM-MSCs 進(jìn)行第二輪共培養(yǎng)，使 MAF-2 和 MAF-12 細(xì)胞的附著生長行為發(fā)生改變。

為了分離與 hBM-MSCs 共培養(yǎng) 4 周后恢復(fù)附著生長的紅色熒光癌細(xì)胞，加入 G418 以清除基質(zhì)細(xì)胞，然后進(jìn)行克隆，報(bào)告顯示了MAF-2與hBM-MSCs共培養(yǎng)的5個克隆細(xì)胞（MAF-BMSC-1—5）的形態(tài)。不同的形態(tài)和恢復(fù)的附著生長行為是穩(wěn)定的。然后進(jìn)行了另一輪蛋白質(zhì)印跡分析以評估標(biāo)記蛋白表達(dá)的狀態(tài)。盡管重新采用了附著生長，但所有五個 MAF-BMSC 克隆都更接近親本 MAF-2 細(xì)胞的表達(dá)模式，顯示 ERα 表達(dá)降低、PR 表達(dá)丟失和 EGFR1 水平升高。但E-cad水平仍然很低，波形蛋白仍然檢測不到。因此，從第二輪共培養(yǎng)中分離的克隆與親本 MAF-2 和祖代 RMCF7-2 細(xì)胞都具有離散的異質(zhì)性。

最后，實(shí)驗(yàn)評估了連續(xù)共培養(yǎng)是否會導(dǎo)致與親代細(xì)胞行為異質(zhì)性的癌細(xì)胞變化。與RMCF7-2細(xì)胞相比，從連續(xù)共培養(yǎng)（MAF-BMSC-1、-3和-5）中選擇的克隆細(xì)胞均顯示出更快的細(xì)胞增殖（圖4 A）、更高的遷移能力（圖4 B）和較大的異種移植腫瘤形成（圖4 C），盡管行為變化在克隆細(xì)胞之間的程度不同。有趣的是，MAF-2 和 MAF-12 的增殖和遷移都很緩慢（圖4 A、B），而使用相同接種方案的重復(fù)動物研究表明 MAF-2 和 MAF-12 細(xì)胞不能形成異種移植腫瘤（圖4 C）。因此，未來需要進(jìn)一步檢查以確定RMCF7-2和HC共培養(yǎng)的其他克隆細(xì)胞是否也失去了異種移植腫瘤形成的潛力。

圖4 與旁觀者細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)行為異質(zhì)性。將選定的MAF-BMCS克?。?1、-3和-5）與親本MAF克?。?2和-12）和祖本RMCF7-2克隆的行為變化進(jìn)行比較。

總之，該研究使用連續(xù)共培養(yǎng)來模擬骨腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞與浸潤的HCs和固有BM-MSCs的相互作用，表明在連續(xù)共培養(yǎng)下，與旁觀者細(xì)胞的相互作用會引起yong久性的形態(tài)學(xué)、生長行為和基因表達(dá)變化，這是研究乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的有力模型。與這項(xiàng)研究相關(guān)的是，需要對其他 MAF 克隆進(jìn)行額外的行為分析，以確定 RMCF7-2 和 HCs 之間的共培養(yǎng)是否使懸浮液中的所有癌細(xì)胞在相同參數(shù)下侵襲性降低，還需要分析其他基因表達(dá)變化，以揭示第二輪共培養(yǎng)后新獲得的侵襲性的其他伴隨表達(dá)變化。腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性證實(shí)了乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的過程，腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性處于動態(tài)狀態(tài)，最有可能由腫瘤細(xì)胞和旁觀者細(xì)胞之間的持續(xù)相互作用來維持。闡明腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性進(jìn)展的機(jī)制是腫瘤轉(zhuǎn)移研究的目標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：Wang R, Wang X, Yin L, Yin L, Chu GC, Hu P, Ou Y, Zhang Y, Lewis MS, Pandol SJ. Breast Cancer MCF-7 Cells Acquire Heterogeneity during Successive Co-Culture with Hematopoietic and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells. Cells. 2022 Nov 10;11(22):3553. doi: 10.3390/cells11223553. PMID: 36428982; PMCID: PMC9688235.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36428982/

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