動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，可導(dǎo)致心絞痛、心肌梗塞或缺血性中風。血管內(nèi)皮細胞（ECs）在動脈粥樣硬化發(fā)展初期到晚期階段起著核心作用。內(nèi)皮極性是維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)功能所必需的，包括剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗凝血作用和屏障功能。內(nèi)皮極性的喪失導(dǎo)致通透性和白細胞募集的增加，并導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)展。

細胞極性是指某些細胞質(zhì)成分在空間順序上的分布不均勻，導(dǎo)致細胞器和細胞骨架等細胞成分組織不對稱。細胞極性主要有兩種類型，第一種類型是頂-底極性（ABP），另一種類型是平面極性（PCP）。平面細胞極性指極性細胞沿著一個共同的平面統(tǒng)一排列（上皮細胞平面細胞極性與頂端-基底的極性垂直）。越來越多的研究表明，內(nèi)皮極性受流動剪切應(yīng)力（FSS）的調(diào)控，而層流剪切應(yīng)力（LSS）促進內(nèi)皮PCP的形成。然而，振蕩剪切應(yīng)力（OSS）對內(nèi)皮PCP的影響尚不清楚。

TET1（10-11 轉(zhuǎn)位蛋白1）是催化 DNA 去甲基化的關(guān)鍵蛋白，主要在早期胚胎細胞中高表達。TET1 的截短異構(gòu)體——TET1s，其蛋白結(jié)構(gòu)缺失 CXXC 結(jié)合域，廣泛在成體組織表達，并有研究指出 TET1s 通過非 DNA 去甲基化途徑調(diào)控基因表達。

重慶大學(xué)生物工程學(xué)院、生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點實驗室王貴學(xué)教授、邱菊輝研究員課題組在之前的研究表明，TET1s參與保護血管內(nèi)皮屏障，其表達受不同剪切應(yīng)力的調(diào)節(jié)。在進一步的深入研究中，該課題組又在體內(nèi)和體外實驗中，探討了 TET1s 在 FSS 對內(nèi)皮細胞 PCP 的調(diào)節(jié)中的作用。相關(guān)研究成果發(fā)表在 APL Bioengineering 期刊題為“Oscillatory shear stress-induced downregulation of TET1s injures vascular endothelial planar cell polarity by suppression of actin polymerization"。

shou先，在大鼠主動脈弓內(nèi)彎施加OSS（5?dyn/cm2），在胸主動脈施加LSS（12?dyn/cm2）刺激ECs，通過比較主動脈弓和胸主動脈的內(nèi)皮形態(tài)學(xué)差異，探討OSS對ECs PCP的影響。與胸主動脈ECs相比，主動脈弓內(nèi)彎的ECs伸長率降低、核橢圓度降低、細胞密度增加。

細胞骨架（微管/MT 和微絲/F-肌動蛋白）的分布和排列是 ECs 中 PCP 的重要特征。與胸主動脈的ECs相比，主動脈弓內(nèi)彎的ECs長軸上游的微管組織中心（MTOC）顯著增加，兩側(cè)顯著降低，下游無差異。然后研究了肌動蛋白細胞骨架的重排。結(jié)果表明，胸主動脈ECs中含有大量平行于細胞長軸排列的F-肌動蛋白，且大部分橫貫細胞。相比之下，主動脈弓 ECs 沿細胞邊緣呈圓形的 F-肌動蛋白線，細胞中僅存在少量長度較短的 F-肌動蛋白（圖1 a）。血流誘導(dǎo)的極化ECs高爾基體主要位于核長軸上游，是PCP的標志。通過免疫熒光觀察高爾基體在主動脈弓和胸主動脈內(nèi)彎的ECs中的細胞內(nèi)定位，發(fā)現(xiàn)高爾基體主要分布在核長軸的上游和兩側(cè)，少數(shù)高爾基體分布在胸主動脈ECs的下游，主動脈弓內(nèi)彎ECs上游的高爾基體明顯減少，而兩側(cè)的高爾基體明顯增加。

這些結(jié)果表明，與LSS相比，OSS在體內(nèi)抑制了血管內(nèi)ECs中的PCP。

圖1 C57BL/6J小鼠（WT小鼠）胸主動脈和主動脈弓內(nèi)皮細胞f -肌動蛋白（綠色）和細胞核（藍色）的免疫熒光染色和表面。

為了進一步研究OSS對內(nèi)皮PCP的影響，HUVECs通過體外平行板流室裝置暴露于LSS或OSS 48小時，觀察不同剪切應(yīng)力刺激的ECs的形態(tài)變化。結(jié)果表明，與LSS相比，在OSS條件下細胞伸長受到顯著抑制。

然后研究了不同剪切應(yīng)力對HUVEC細胞骨架（包括微管和微絲）的影響。與LSS刺激的HUVECs相比，OSS顯著增加了MTOC在細胞核長軸上游的分布，但降低了核兩側(cè)的分布。體外培養(yǎng)的微絲的形態(tài)與體內(nèi)相似。LSS刺激的HUVECs含有大量的F-肌動蛋白，平行于細胞的長軸排列，且大部分F-肌動蛋白也橫穿細胞。相比之下，OSS 刺激的 HUVECs 沿細胞邊緣呈環(huán)形 F-肌動蛋白帶，細胞中也存在少量長度較短的 F-肌動蛋白.在體外，與LSS相比，高爾基體更有可能分布在暴露于OSS的HUVECs中細胞核長軸的兩側(cè)。這種現(xiàn)象在體外比在體內(nèi)更明顯。

這些結(jié)果表明，OSS在體內(nèi)和體外均抑制血管內(nèi)皮細胞PCP。

接下來，為了研究不同剪切應(yīng)力對ECs中TET1s表達的影響，將HUVECs暴露于LSS或OSS中48 h。免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與LSS相比，OSS組的TET1s表達水平顯著降低。這些結(jié)果表明，OSS抑制了ECs中TET1s的表達。

為了檢驗 TET1 的降低是否是 OSS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮 PCP 損傷的關(guān)鍵因素，研究人員構(gòu)建了一種 TET1s 過表達的腺病毒來轉(zhuǎn)染暴露于 OSS 的HUVECs（圖2 a、b）。與對照（NC）組相比，過表達TET1s（OE）組的細胞伸長率顯著增加（圖2 c、d）。然而，核橢圓度沒有顯著變化，它可能是由與流動相關(guān)的其他通路調(diào)節(jié)的，而不是由TET1s調(diào)節(jié)的。

此外，還測試了TET1s過表達對暴露于OSS的HUVECs中內(nèi)皮細胞骨架和高爾基體定位的影響。在TET1s過表達的HUVECs中，F(xiàn)-肌動蛋白的數(shù)量和長度顯著增加，且大部分F-肌動蛋白平行于血流方向，而MTOC和高爾基體相對于細胞核的定位沒有差異。

這些數(shù)據(jù)表明，TET1s過表達可以挽救OSS抑制的內(nèi)皮PCP。

圖2 過表達的 TET1 挽救了 OSS 抑制的內(nèi)皮 PCP。

因為內(nèi)皮微管和高爾基體的定位和分布沒有明顯受到影響，因此，重點研究了TET1s對微絲的影響。結(jié)果顯示，敲除TET1s的表達降低了LSS誘導(dǎo)的HUVECs中F-肌動蛋白聚合的數(shù)量和長度，并且平行于流動方向的F-肌動蛋白的排列也顯著降低。通過比較小鼠TET1?/? 和TET1cs/cs 之間胸主動脈 ECs 的差異，發(fā)現(xiàn)TET1s的缺乏降低了F-肌動蛋白的聚合率和長度。

分泌型卷曲相關(guān)蛋白-1（sFRP-1）調(diào)節(jié) EC 細胞骨架重組，其表達受表觀遺傳途徑調(diào)控。為了進一步探討TET1s參與內(nèi)皮PCP調(diào)控的機制，對TET1?/?小鼠和TET1CS/CS小鼠血漿中sFRP-1水平進行ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)TET1s缺失可顯著降低血漿sFRP-1水平，RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)TET1s的缺失可顯著降低sFRP-1的mRNA水平。相反，在體外，暴露于 OSS 的 HUVECs 中過表達的 TET1s 增加了sFRP-1 的表達和分泌。

ECs高度表達Fzd家族成員卷曲蛋白4（Fzd4），并已證實sFRP-1/Fzd4調(diào)節(jié)細胞骨架重組。通過免疫沉淀技術(shù)，實驗證實了OSS顯著降低了sFRP-1/Fzd4的相互作用。然而，TET1s 的過表達部分恢復(fù)了 OSS 抑制的 sFRP-1 與 Fzd4 的相互作用。

為了確認 sFRP-1/Fzd4 信號通路參與 TET1s 誘導(dǎo)的 F-肌動蛋白聚合，將 sFRP-1 干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到過表達的 TET1s HUVECs中，從而敲低 sFRP-1 的表達（圖3 a-c），結(jié)果表明，敲低 sFRP-1 表達損害了 TET1s 誘導(dǎo)的 F-肌動蛋白聚合（圖3 d、e）。

這些數(shù)據(jù)表明，TET1s的缺乏損害了LSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞PCP，SFRP-1/Fzd4介導(dǎo)TET1S誘導(dǎo)的F-肌動蛋白聚合。

圖3 敲低 sFRP-1 阻斷 TET1s 誘導(dǎo)的內(nèi)皮 F-肌動蛋白聚合。

上述已經(jīng)證明 TET1s 促進 ECs 中 sFRP-1 的表達，但其機制尚不清楚。最后，實驗研究了TET1s是否通過DNA去甲基化促進ECs中sFRP-1的表達，通過dot-blot實驗檢測了暴露于OSS的過表達TET1s HUVECs的整體DNA甲基化（5mC）和羥甲基化（5hmC）水平。結(jié)果表明，過表達的TET1s不會導(dǎo)致整體DNA甲基化和羥甲基化水平的變化。采用DNA免疫沉淀-qPCR分析CpG島的羥甲基化水平，結(jié)果表明，過表達的TET1s增加了sFRP-1基因啟動子的第二個CpG島的羥甲基化水平。此外，TET1s顯著降低了sFRP-1基因啟動子的第二個CpG島的甲基化水平。這些結(jié)果表明，TET1s的過表達介導(dǎo)了sFRP-1基因啟動子的去甲基化。

因此，這些結(jié)果表明，TET1s是FSS誘導(dǎo)的內(nèi)皮PCP調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素。該調(diào)節(jié)是通過改變 sFRP-1 啟動子的去甲基化，從而影響 sFRP-1/Fzd4 的相互作用，并最終介導(dǎo) F-肌動蛋白。

綜上所述，該研究表明，TET1s 參與調(diào)節(jié) FSS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮 PCP 變化。TET1s 促進 sFRP-1 啟動子區(qū)域的 sFRP-1 去甲基化水平。作為EC細胞骨架重組的調(diào)控因子，sFRP-1的高表達通過sFRP-1/Fzd4信號通路導(dǎo)致F-肌動蛋白聚合，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮PCP。這些發(fā)現(xiàn)不僅擴展了我們對TET1s在OSS誘導(dǎo)的PCP損傷中的作用的理解，而且可用于OSS驅(qū)動的血管疾病的潛在治療。

參考文獻：Qu K, Wang C, Huang L, Qin X, Zhang K, Qiu J, Wang G. Oscillatory shear stress-induced downregulation of TET1s injures vascular endothelial planar cell polarity by suppression of actin polymerization. APL Bioeng. 2023 Jul 31;7(3):036104. doi: 10.1063/5.0141289. PMID: 37533755; PMCID: PMC10393427.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37533755/

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