動(dòng)脈粥樣硬化的特征主要表現(xiàn)為血管內(nèi)層（內(nèi)膜）出現(xiàn)脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增生等改變，形成斑塊。通過與細(xì)胞外基質(zhì)分子（尤其是蛋白聚糖）相互作用，致動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白在內(nèi)皮下基質(zhì)中的沉積被認(rèn)為是關(guān)鍵的潛在機(jī)制。在病理?xiàng)l件下，脂蛋白會(huì)發(fā)生氧化、糖化、水解和硫酸化等改變，從而促進(jìn)炎癥并增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化生成過程。

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成常發(fā)生在動(dòng)脈分叉處，此時(shí)血流模式為湍流，產(chǎn)生不均勻的剪切應(yīng)力。粥樣斑塊的區(qū)域的湍流模式會(huì)引起炎癥反應(yīng)增加，這反過來似乎增加了斑塊破裂的可能性。因此，動(dòng)脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）表達(dá)更高水平的炎癥觸發(fā)因子，從而使斑塊的不穩(wěn)定性增加，導(dǎo)致斑塊破裂或斑塊侵蝕。

血管ECs的管腔表面被糖萼覆蓋，糖萼是1-5μm厚的細(xì)胞外層，由糖胺聚糖、蛋白聚糖和糖蛋白組成。完整的糖萼被認(rèn)為具有動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用。硫酸乙酰肝素（HS）是表面糖萼層的糖胺聚糖成分，具有許多可能影響動(dòng)脈粥樣硬化生成的功能。在心血管ECs的糖萼中發(fā)現(xiàn)的主要硫酸肝素蛋白聚糖（HSPGs）主要包括位于細(xì)胞膜表面的磷脂酰肌醇蛋白多糖家族（glypicans，GPCs）和多配體蛋白多糖家族（syndecans，SDCs）以及位于細(xì)胞外基質(zhì)中的基膜蛋白多糖（perlecan/HSPG2）。其中，SDC1或SDC4缺失可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，即使在通常受層流保護(hù)的區(qū)域也是如此。然而，迄今為止只研究了有限數(shù)量的蛋白聚糖。特別是，glypican-4（GPC4）的作用尚不清楚。GPC4作為一種脂肪因子調(diào)節(jié)胰島素受體信號(hào)傳導(dǎo)，因此可能與肥胖和心血管疾病相關(guān)，但尚不清楚內(nèi)皮細(xì)胞GPC4的表達(dá)是否在動(dòng)脈粥樣硬化形成中起作用。

最近，德國埃爾朗根-紐倫堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院心臟病學(xué)和心血管學(xué)系、紐倫堡總醫(yī)院血管及腔內(nèi)血管外科及加拿大阿爾伯塔大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院的一項(xiàng)聯(lián)合研究假設(shè)內(nèi)皮細(xì)胞GPC4的表達(dá)通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮活化和免疫細(xì)胞粘附在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中發(fā)揮作用。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences  期刊題為“The Shear Stress-Regulated Expression of Glypican-4 in Endothelial Dysfunction In Vitro and Its Clinical Significance in Atherosclerosis"。

首先，實(shí)驗(yàn)使用流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)了GPC4在人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUAECs）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中表達(dá)，而且無論孵育時(shí)間或樣本性別如何，HUVECs中的GPC4表達(dá)均高于HUAECs。然后在有或沒有腫瘤壞死因子（TNF）-α刺激的HUVECs和HUVECs中，分別觀察第0天和第7天mRNA的表達(dá)水平。大多數(shù)分析的基因（總共26個(gè)基因）對(duì)TNF-α刺激沒有反應(yīng)，GPC4 表達(dá)不受TNF-α刺激的影響，尤其是在HUVECs 中。分析表明，GPC4表達(dá)可能與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的差異表達(dá)相關(guān)，無論是在第7天還是在第0天以及有與沒有TNF-α刺激的條件下。

接下來，將 HUVECs 暴露于流動(dòng)刺激中 1 天或 10 天（10.2-10.8 dyne/cm2，即高剪切應(yīng)力、層流模式；2.5-3.5 dyne/cm2，即低剪切應(yīng)力、不均勻的流動(dòng)模式），并使用免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察 GPC4 和 HS（圖1 A）。在初步實(shí)驗(yàn)中，HUAECs和HUVECs之間GPC4和HS的表達(dá)沒有差異，因此，僅使用HUVECs進(jìn)行動(dòng)態(tài)流動(dòng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果觀察到免疫標(biāo)記的GPC4和HS在層流區(qū)和湍流區(qū)在1天后的熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)，在10天后減弱。

在1天和10天的流動(dòng)刺激后，GPC4在非均勻流區(qū)的表達(dá)較層流區(qū)顯著降低（圖1 B，左）。GPC4的表達(dá)隨流動(dòng)時(shí)間的延長總體呈下降趨勢。在層流和非均勻剪切應(yīng)力區(qū)域，1天后HS的校正細(xì)胞總熒光有顯著差異，但在10天后無差異（圖1 B，右）。此外，觀察到HS表達(dá)模式的流動(dòng)依賴性差異，在1天的流動(dòng)之后，層流區(qū)域觀察到網(wǎng)狀模式，在非均勻剪切應(yīng)力區(qū)域存在連續(xù)中斷，而10天后，兩個(gè)區(qū)域的模式都被破壞（圖1 C）。這說明GPC4的表達(dá)受剪切應(yīng)力的調(diào)控。

圖1    流動(dòng)條件下HUVECs中GPC4的表達(dá)。

在1天或10天的流動(dòng)暴露后，用TNF-α刺激HUVECs，并量化THP-1細(xì)胞的粘附。在兩個(gè)暴露期，與非均勻剪切應(yīng)力區(qū)相比，層流區(qū)域的THP-1粘附細(xì)胞數(shù)量顯著降低。非均勻區(qū)THP-1細(xì)胞粘附數(shù)量在10天后比1天后有增加的趨勢。

為了研究內(nèi)皮GPC4是否在THP-1細(xì)胞粘附中起作用，通過siRNA轉(zhuǎn)染在HUVECs中敲低GPC4，并進(jìn)行粘附測定。轉(zhuǎn)染GPC4 siRNA的HUVECs在層流和非均勻剪切應(yīng)力區(qū)THP-1細(xì)胞粘附顯著高于轉(zhuǎn)染對(duì)照 siRNA的HUVECs，而VCAM-1和E-selectin的表達(dá)無顯著差異。用HS降解酶肝素酶III處理可降低HUVECs中的HS，但對(duì)THP-1單核細(xì)胞粘附無影響。此外，肝素酶III處理對(duì)GPC4 siRNA轉(zhuǎn)染的ECs對(duì)THP-1細(xì)胞粘附?jīng)]有額外的影響。

進(jìn)一步地，實(shí)驗(yàn)還分析了GPC4在體外表達(dá)中的可能的性別差異。雖然在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的ECs的FACS分析中未觀察到性別差異，但發(fā)現(xiàn)，在層流和非均勻剪切應(yīng)力區(qū)域的流動(dòng)條件下，與男性樣本相比，女性的GPC4蛋白表達(dá)往往更高。此外，層流和非均勻剪切應(yīng)力區(qū)域之間的差異在女性中比在男性中更明顯。然而，在HS的表達(dá)或THP-1細(xì)胞的粘附方面，男性和女性之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。

此外，還分析了糖萼成分在人類動(dòng)脈粥樣硬化病變中的分布。GPC4、HS和 SDC4 的表達(dá)百分比在炎癥較重的PS中低于炎癥較輕的PS（圖2）。相關(guān)性分析表明，SDC4與HS的表達(dá)在重度和輕度炎癥的PS中均呈正相關(guān)，GPC4和HS之間以及GPC4和SDC4在炎癥較輕的PS中也觀察到這些正相關(guān)的趨勢。此外，HS與GPC4、HS與SDC4的表達(dá)也呈顯著正相關(guān)。

圖2    GPC4、HS和SDC4在所有斑塊切片（plaque sections，PS）中的表達(dá)。

最后，實(shí)驗(yàn)將所有斑塊切片分為脆弱、穩(wěn)定或初始斑塊部分。初始斑塊切片顯示糖萼分子都沒有顯著差異。在穩(wěn)定斑塊切片中，SDC4和HS在炎癥程度較高和較低的PS區(qū)域的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在GPC4中未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在脆弱的斑塊切片中，與炎癥較輕的PS相比，炎癥較重的PS中GPC4明顯降低，而HS受影響較小。SDC4無顯著差異。

還比較了不同斑塊類型炎癥程度較高的PS中糖萼分子的表達(dá)模式。與脆弱斑塊和穩(wěn)定斑塊相比，GPC4和HS在初始斑塊中表達(dá)最高，而SDC4在這些斑塊類型中表達(dá)無差異（圖3 A、B）。有趣的是，僅在脆弱的斑塊切片中觀察到糖萼分子與炎癥程度較高的PS中CD68表達(dá)決定的局部炎癥呈強(qiáng)烈負(fù)相關(guān)，而在初始斑塊或穩(wěn)定斑塊切片中則沒有觀察到。這說明，糖萼成分的內(nèi)皮表達(dá)取決于斑塊易損性和局部炎癥。

圖3    GPC4 （A）和HS（B）在不同斑塊類型切片中的表達(dá)比較。

該研究在體外和體內(nèi)證明了不同糖萼分子在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn)。動(dòng)態(tài)粘附測定顯示，GPC4在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的早期階段通過減弱免疫細(xì)胞對(duì)EC的早期粘附而具有潛在作用。GPC4和HS在人動(dòng)脈粥樣硬化病變中的du特表達(dá)突出了對(duì)炎癥和斑塊易損性的影響。雖然需要進(jìn)一步的研究來闡明不同的機(jī)制，但上述數(shù)據(jù)表明內(nèi)皮糖萼在心血管疾病中的臨床意義。

參考文獻(xiàn)：Urschel K, Hug KP, Zuo H, Büttner M, Furtmair R, Kuehn C, Stumpfe FM, Botos B, Achenbach S, Yuan Y, Dietel B, Tauchi M. The Shear Stress-Regulated Expression of Glypican-4 in Endothelial Dysfunction In Vitro and Its Clinical Significance in Atherosclerosis. Int J Mol Sci. 2023 Jul 18;24(14):11595. doi: 10.3390/ijms241411595. PMID: 37511353; PMCID: PMC10380765.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37511353/

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