退行性椎間盤疾?。―DD）是一種慢性脊柱疾病，其特征是椎間盤（IVD）結構退變、蛋白水解活性增加、髓核（NP）細胞死亡和促炎細胞因子釋放。非生理性機械應力（MS）被認為是發(fā)生腰椎DDD的重要危險因素。過度的MS會導致細胞死亡和細胞外基質（ECM）降解，從而導致IVD的顯著結構變化。壞死性凋亡和細胞凋亡是與腰椎DDD有關的兩種主要程序性細胞死亡類型。盡管研究證據越來越多，但MS誘導的DDD的機制尚未wan全闡明。

MS誘導的線粒體活性氧（ROS）生成具有多種復雜機制，包括細胞內Ca²⁺ 超載和細胞骨架應變。一些研究強調了線粒體ROS在NP細胞機械損傷中的重要性。過量的ROS生成通過對蛋白質、核酸、脂質和細胞器造成損害來激活多種細胞凋亡途徑。近年來，越來越多的研究強調了線粒體ROS在NP細胞程序性死亡中的關鍵作用，為腰椎DDD的進展提供了重要的新見解。

一些研究表明，高強度負荷是導致DDD的一個重要因素?；谶@一發(fā)現(xiàn)，中山大學附屬第七醫(yī)院骨科、附屬第一醫(yī)院脊柱外科，深圳大學第一附屬醫(yī)院運動醫(yī)學科學科以及北京市創(chuàng)傷骨科研究所的一項聯(lián)合研究曾成功建立了椎間盤退變器官培養(yǎng)模型，目的是研究MS后程序性細胞死亡，ECM變性和線粒體ROS產生的發(fā)生。更重要的是，通過測量細胞反應來評估MS、線粒體ROS、程序性細胞死亡和ECM變性的相關性，以幫助闡明DDD的分子病理生理學。相關內容發(fā)表在 Oxidative Medicine and Cellular Longevity 期刊題為“Programmed NP Cell Death Induced by Mitochondrial ROS in a One-Strike Loading Disc Degeneration Organ Culture Model"。

首先，實驗先檢測MS（40%應變，1-7天）后不同時間點NP細胞中的ROS產生。數(shù)據顯示，MS顯著增加了ROS陽性細胞比例，并在前12小時內保持在穩(wěn)定的高水平，之后，ROS陽性細胞的比例急劇下降，并在48小時達到低水平，而生理負荷培養(yǎng)組ROS陽性細胞比例保持穩(wěn)定。線粒體電子傳遞抑制劑魚藤酮顯著降低了MS后ROS陽性細胞的比例（~78%），線粒體ROS清除劑MitoQ也顯著降低了ROS陽性細胞的比例（~73%）。

然后，采用JC-1染色用于監(jiān)測MS后NP組織中的線粒體膜電位，觀察到MS組NP細胞線粒體膜電位顯著降低，MitoQ預處理可部分減弱此效應。這些結果表明，MS能夠直接誘導線粒體功能障礙。此外，計算GSSG/總谷胱甘肽比值以進一步評估NP組織中的ROS水平，觀察到MS處理提高了GSSG/總谷胱甘肽比值，MitoQ預處理減弱了此效應，而且MitoQ顯著抑制了MS引起的過氧化氫酶（CAT）的mRNA表達。這些結果表明，時間依賴性ROS積累主要來源于MS后的線粒體。

接下來，為了探索MS后NP細胞死亡機制，實驗培養(yǎng)了IVD，并隨后分析了不同時間點的細胞活力。MS在IVD中的應用導致NP細胞活力的顯著時間依賴性降低（圖1 a、b），一小部分NP細胞在MS后立即死亡，超過70%的NP細胞死亡發(fā)生在MS后12至48小時內。因此，MS后細胞死亡的程度和機制隨時間而變化。MS處理12小時后NP細胞活力的急劇下降表明，除了由MS直接引起的壞死外，程序性細胞死亡也被激活。因此，IVDs用Z-VAD-FMK、Nec-1或MitoQ預處理2小時，然后進行MS，細胞活力分析表明，與MS組相比，抑制劑預處理顯著減輕了NP細胞的死亡（圖1 c）。

圖1    MS誘導的NP細胞死亡的時間過程。

進一步地，實驗研究了細胞凋亡指示基因（CASPASE3、BCL2和BAX）和壞死性凋亡指示基因（RIP1、RIP3和MLKL）的相對變化。MS后12小時，細胞凋亡和壞死性凋亡基因的mRNA表達水平顯著升高，MitoQ預處理緩解了部分變化（CASPASE3、RIP1、RIP3和MLKL）。免疫熒光染色結果顯示，在MS后12小時，細胞凋亡和壞死性凋亡（MLKL）基因水平顯著增加，MitoQ預處理顯著抑制程序性細胞死亡相關標志物MLKL、CASPASE3和BAX的表達，提高BCL2的表達。此外，TUNEL染色表明MitoQ顯著逆轉了MS引起的NP細胞凋亡。

為了確定MS是否對NP細胞程序性死亡有長期影響，在7天持續(xù)的MS組中測量了細胞凋亡和壞死性凋亡基因和蛋白質的mRNA/蛋白質水平。結果表明，這些標志物的水平在7天MS組和7天CON組之間沒有顯著差異，凋亡水平同樣無顯著差異。

此外，還對NP組織進行了代謝分析。與CON組（0.02-0.2?MPa；0.2?Hz；1 hour/day）相比，MS組在MS后12小時表現(xiàn)出上調的分解代謝基因（MMP1、MMP3和ADAMTS5）表達水平和下調的膠原II型α1（COL2A1）表達水平，MitoQ預處理可部分緩解MS誘導的代謝失調。為了進一步研究代謝失調的程度，使用DMMB方法分析了累積糖胺多糖（GAG）釋放，MS在第7天顯著增加了累積GAG的釋放量，MitoQ 預處理部分防止了 GAG 的丟失。

zui后，觀察了IVDs的動態(tài)壓縮剛度和形態(tài)。在MS后的第一天，CON、MS和MitoQ + MS組的動態(tài)壓縮剛度變化沒有顯著差異（圖2 c）。與CON組相比，MS組IVDs在第7天表現(xiàn)出顯著較低的剛度，但這種差異被MitoQ減弱（圖2 d）。這些結果表明，MS部分通過線粒體ROS降低了IVD的硬度。然后，通過Safranin O/Fast Green和蘇木精染色評估IVDs的形態(tài)。MS應用7天后，MS組的退行性變評分明顯高于CON組。此外，MS應用后第4天和第7天之間的退化評分沒有顯著差異。在MitoQ預處理的IVDs中，退行性變評分顯著降低（圖2 e、f）。

圖2    線粒體ROS參與MS誘導的IVD動態(tài)壓縮剛度降低和形態(tài)退行性改變。

總之，該研究的數(shù)據表明，在MS后的早期時間點，ROS誘導程序性NP細胞死亡和ECM降解，這些累積的ROS主要來自線粒體。這些發(fā)現(xiàn)表明，在MS后立即使用線粒體靶向的抗氧化劑可能是預防DDD發(fā)病或進展的有希望的方法。研究結果也為DDD的病理機制提供了新的見解。

參考文獻：Li BL, Liu X, Gao M, Zhang F, Chen X, He Z, Wang J, Tian W, Chen D, Zhou Z, Liu S. Programmed NP Cell Death Induced by Mitochondrial ROS in a One-Strike Loading Disc Degeneration Organ Culture Model. Oxid Med Cell Longev. 2021 Aug 31;2021:5608133. doi: 10.1155/2021/5608133. PMID: 34512867; PMCID: PMC8426058.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34512867/

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