淋巴細(xì)胞歸巢主要是淋巴細(xì)胞表面的歸巢受體與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子-血管地址素的相互作用為基礎(chǔ)定向移動的一種遷移活動，是由相關(guān)黏附分子相互作用的一個多步級聯(lián)反應(yīng)過程，其中最主要的黏附分子是整合素α4β7。整合素α4β7是一種歸巢受體分子，通過與粘膜血管地址素細(xì)胞黏附分子-1（MAdCAM-1）相互作用，可介導(dǎo)循環(huán)淋巴細(xì)胞在粘膜組織的血管內(nèi)皮表面的滾動和穩(wěn)定黏附。在此過程中，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)鈣信號。鈣信號調(diào)節(jié)多種淋巴細(xì)胞過程，包括淋巴細(xì)胞發(fā)育、T細(xì)胞和B細(xì)胞活化、基因轉(zhuǎn)錄和效應(yīng)功能。雖然整合素α4β7對于循環(huán)淋巴細(xì)胞的黏附和遷移至關(guān)重要，但整合素α4β7 參與淋巴細(xì)胞的鈣反應(yīng)目前尚不清楚。

整合素 α4β7和 MAdCAM-1 分子間的鍵合和解離，發(fā)生在血液環(huán)境中，因此該過程除了受內(nèi)在化學(xué)因素的影響外，還受血流剪切應(yīng)力環(huán)境影響。通過G蛋白偶聯(lián)受體通路激活整合素α4β7 依賴于流體剪切應(yīng)力，隨后的鈣信號事件受流動力的影響。因此，尚不清楚外力能否調(diào)節(jié)整合素 α4β7/MAdCAM-1引發(fā)的鈣反應(yīng)。

細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和細(xì)胞外鈣內(nèi)流是增加淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 水平的兩種主要機制。然而，細(xì)胞質(zhì)Ca2+ 濃度上調(diào)的途徑和整合素α4β7介導(dǎo)的鈣反應(yīng)的參與機制以及參與該信號通路的關(guān)鍵分子尚不清楚。迄今為止，許多作為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用支架的銜接蛋白與整合素從外向內(nèi)"信號傳導(dǎo)有關(guān)。整合素活化蛋白Kindlin-3是Kindlin家族中白細(xì)胞中特異性表達的成員，參與“由內(nèi)向外"（intside-out）和“從外向內(nèi)"（outside-in）信號傳導(dǎo)。因此，需要進一步的研究來闡明Kindlin-3在整合素α4β7 介導(dǎo)的鈣信號中的作用。

在華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院生物力學(xué)研究所、廣東省生物制藥工程技術(shù)研究中心（華南理工大學(xué)）的一項研究中，使用結(jié)合熒光顯微鏡和平行平板流動腔的系統(tǒng)探討了由整合素α4β7 介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞模型RPMI 8226細(xì)胞的細(xì)胞間鈣反應(yīng)。在不同流動剪切應(yīng)力下整合素α4β7 與MAdCAM-1結(jié)合引發(fā)的鈣信號事件用延遲時間、峰值時間和峰值鈣強度來描述，研究結(jié)果為分子水平上的細(xì)胞生理過程提供了新的視角。研究成果發(fā)表在 Biomolecules 期刊題為“Force-Regulated Calcium Signaling of Lymphoid Cell RPMI 8226 Mediated by Integrin α4β7/MAdCAM-1 in Flow"。

首先，為了研究流體條件下RPMI 8226細(xì)胞中整合素α4β7介導(dǎo)的鈣信號，實驗評估了RPMI 8226細(xì)胞的穩(wěn)定黏附和鈣反應(yīng)。使用平行板流動室與熒光檢測系統(tǒng)（圖1），發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在0.3 dyn/cm2的壁剪切應(yīng)力下黏附在鋪有MAdCAM-1的底板上。與空白對照組相比，用2% BSA（牛血清白蛋白）處理的底板上細(xì)胞的黏附數(shù)目顯著減少，可見 2% BSA 基本能阻斷非特異性黏附作用。此外，在底板上鋪有MAdCAM-1加2% BSA 時，穩(wěn)定黏附的細(xì)胞數(shù)量增加，且與濃度呈正相關(guān)。而當(dāng)?shù)装宓?MAdCAM-1 分子用其抗體 F-6 阻斷時，穩(wěn)定黏附細(xì)胞數(shù)量顯著降低。這些結(jié)果表明，RPMI 8226 細(xì)胞能黏附在鋪有 MAdCAM-1 的底板上是由MAdCAM-1與其受體整合素α4β7 之間的特異性相互作用介導(dǎo)的。

圖1    平行平板流動室與熒光檢測系統(tǒng)相結(jié)合的示意圖。深綠色細(xì)胞代表穩(wěn)定粘附在MAdCAM-1底板上的RPMI 8226細(xì)胞，其鈣信號被激活。淺綠色細(xì)胞僅在底板表面滑動，并包含鈣信號的背景。

接下來，實驗評估了黏附在鋪有2和20 μg/ mL 濃度的MAdCAM-1底板上的RPMI 8226細(xì)胞的鈣反應(yīng)。結(jié)果表明，MAdCAM-1的濃度差異對細(xì)胞鈣信號的產(chǎn)生有顯著影響。隨著MAdCAM-1密度的增加，RPMI 8226細(xì)胞中鈣信號的延遲時間迅速縮短，表明整合素α4β7 和 MAdCAM-1之間的相互作用增強，加速了RPMI 8226細(xì)胞的胞質(zhì)鈣釋放。雖然鈣信號的峰值時間和峰值強度沒有顯著差異，但峰值時間縮短，峰值強度在一定程度上增加。這說明，阻滯整合素α4β7 和 MAdCAM-1的結(jié)合可特異性觸發(fā)RPMI 8226細(xì)胞中的鈣信號，且鈣信號的激發(fā)速率取決于MAdCAM-1的濃度。

關(guān)于機械調(diào)控是否可以通過整合素α4β7 誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞中的鈣信號仍然存在不確定性。因此，評估了RPMI 8226細(xì)胞在0.15、0.30和0.60 dyn/cm2壁剪切應(yīng)力下黏附在10 g/mL MAdCAM-1底板的鈣響應(yīng)。結(jié)果表明，剪切應(yīng)力增強了整合素α4β7和 MAdCAM-1結(jié)合誘導(dǎo)的RPMI 8226的鈣爆釋（calcium bursting）（圖2 A）。增加壁剪切應(yīng)力可以減少鈣信號的延遲（圖2 B）。同樣，鈣信號的峰值時間隨著壁剪切應(yīng)力的增大而減少（圖2 C）。相反，峰值強度（鈣信號的最高量）隨著壁剪切應(yīng)力的增加而增加（圖2 D）。這些結(jié)果表明，由整合素α4β7 和MAdCAM-1的相互作用引發(fā)的RPMI 8226的鈣信號受到壁面剪切應(yīng)力的正向調(diào)控，外力可加快鈣信號的爆釋速度，增強鈣信號的強度。

圖2    穩(wěn)定黏附的RPMI 8226細(xì)胞的力調(diào)控鈣信號。

在鋪有10 μg/mL MAdCAM-1濃度底板上穩(wěn)定粘附的 RPMI 8226細(xì)胞在0.15、0.30和0.60 dyn/cm2 的剪切應(yīng)力下，鈣信號的（A）時程、（B）延遲時間、（C）峰值時間和（D）峰值強度。

然后，為了確定鈣爆釋是由胞質(zhì)鈣釋放還是細(xì)胞外鈣內(nèi)流引起的，用抑制劑2-APB和LaCl3分別處理RPMI 8226細(xì)胞，以0.30 dyn/cm2的壁剪切應(yīng)力灌流到流動室中。結(jié)果表明，不同抑制劑處理導(dǎo)致鈣信號激活的顯著差異。2-APB處理對延遲時間、峰值時間或峰值強度無顯著影響，提示2-APB阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道不影響RPMI 8226細(xì)胞中的鈣信號。然而，LaCl3顯著增加了延遲和峰值時間，并削弱了峰值強度。也就是說，由整合素α4β7引發(fā)的RPMI 8226細(xì)胞中的鈣爆釋可能通過使用LaCl3抑制細(xì)胞膜上的鈣通道而被削弱和減緩。這些結(jié)果表明，整合素α4β7和MAdCAM-1相互作用誘導(dǎo)的鈣信號主要依賴于細(xì)胞膜上鈣通道的激活，而不需要鈣釋放。

Kindlin-3是整合素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要銜接劑。然而，Kindlin-3協(xié)助整合素α4β7激活胞質(zhì)鈣爆釋的機制仍不清楚。最后，為了確定Kindlin-3是否參與整合素α4β7激活的鈣信號過程，在RPMI 8226中敲低了Kindlin-3的表達，并在流動條件下檢查了整合素α4β7和 MAdCAM-1相互作用誘導(dǎo)的鈣信號。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RPMI 8226 細(xì)胞系中，Kindlin-3 shRNA沉默的細(xì)胞陽性比例 >90%（圖3 A、B），而且Kindlin-3的表達低于未轉(zhuǎn)染的RPMI 8226細(xì)胞（圖3 C）。Kindlin-3敲低細(xì)胞的典型時間過程顯示鈣信號顯減著弱（圖3 D）。與對照組相比，Kindlin-3的敲低顯著延長了RPMI 8226細(xì)胞中鈣信號傳導(dǎo)的延遲和峰值時間，同時削弱了峰值強度（圖3 E-G），表明Kindlin-3的阻斷可能會干擾由整合素α4β7和 MAdCAM-1相互作用引發(fā)的鈣爆釋。這些結(jié)果表明，Kindlin-3參與由整合素α4β7和 MAdCAM-1之間的相互作用誘導(dǎo)的鈣信號傳導(dǎo)。

圖3   流動條件下沉默Kindlin-3對整合素α4β7/MAdCAM-1 復(fù)合體介導(dǎo)的RPMI 8226細(xì)胞鈣信號的影響。

圖4    整合素α4β7和 MAdCAM-1相互作用誘導(dǎo)循環(huán)淋巴細(xì)胞鈣信號傳導(dǎo)的潛在機制。整合素α4β7 與MAdCAM-1 的結(jié)合在流動條件下通過需要 Kindlin-3 的共同途徑誘導(dǎo)穩(wěn)定粘附的 RPMI 8226 細(xì)胞的力依賴性鈣信號，隨后激活鈣內(nèi)流。

總而言之，該研究發(fā)現(xiàn)整合素α4β7 與MAdCAM-1 的結(jié)合，通過需要Kindlin-3的通路，在穩(wěn)定粘附的RPMI 8226細(xì)胞中導(dǎo)致了力依賴性鈣信號。這些發(fā)現(xiàn)為黏附分子介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號通路的機械化學(xué)調(diào)控機制提供了新的見解，為風(fēng)險評估、臨床診斷以及炎癥性疾病和癌癥治療的有效性的新概念的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。

參考文獻：Sun D, Luo Z, Kong Y, Huang R, Li Q. Force-Regulated Calcium Signaling of Lymphoid Cell RPMI 8226 Mediated by Integrin α4β7/MAdCAM-1 in Flow. Biomolecules. 2023 Mar 24;13(4):587. doi: 10.3390/biom13040587. PMID: 37189336; PMCID: PMC10135767.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37189336/

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