安氏Ⅱ類(lèi)錯(cuò)牙合是口腔正畸學(xué)中的一種臨床疾病。功能矯治器是一種本身不產(chǎn)生任何機(jī)械力，通過(guò)改變頜面部的肌肉環(huán)境，促進(jìn)頜發(fā)育及顱面骨骼生長(zhǎng)的一類(lèi)矯正器。機(jī)械力信號(hào)被傳遞到細(xì)胞中并促進(jìn)骨骼肌重塑。因此，闡明拉伸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步優(yōu)化臨床治療非常重要。

細(xì)胞凋亡的機(jī)制是多種多樣的，其中比較常見(jiàn)的有三種機(jī)制，分別為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）、線粒體通路和死受體通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊和修飾是一個(gè)高度調(diào)控的過(guò)程。然而，各種內(nèi)源性和外源性應(yīng)激可以破壞細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。越來(lái)越多的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也會(huì)導(dǎo)致自噬。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，有助于自噬發(fā)生的IRE1-JNK、PERK-eIF2α和AKT-TSC-mTOR信號(hào)通路在ERS條件下被激活。

未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）是一種高度保守的適應(yīng)性機(jī)制，有三個(gè)分支協(xié)調(diào)對(duì)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的有害累積的反應(yīng)。它們包括：肌醇需求酶1α（IRE1α）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）和激活轉(zhuǎn)錄因子6（AFT6）。CHOP，Caspase-12和JNK是三個(gè)與ER相關(guān)的信號(hào)通路。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在骨骼肌重塑中拉伸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用。激活的ATF-6進(jìn)入細(xì)胞核以促進(jìn)UPR相關(guān)蛋白的表達(dá)。這增加了ER的生物合成能力，從而使細(xì)胞在ERS下存活。當(dāng)ERS被觸發(fā)和延長(zhǎng)時(shí)，ATF-6還可以激活CHOP等下游蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，ATF-6信號(hào)通路在骨骼肌重塑中的作用尚不清楚。

Bcl-2家族蛋白對(duì)于調(diào)節(jié)各種細(xì)胞的凋亡至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，Bcl-2通過(guò)與Beclin1相互作用來(lái)調(diào)節(jié)自噬，Beclin1被稱為自噬的標(biāo)記蛋白。Bcl-2 對(duì)自噬和凋亡的信號(hào)通路存在交叉調(diào)控。然而，目前尚不清楚ATF-6通路是否參與拉伸誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞的凋亡和自噬。

為了解決這個(gè)問(wèn)題，青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔正畸科、青島市立醫(yī)院口腔科的研究團(tuán)隊(duì)曾研究了拉伸誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡和自噬的潛在分子機(jī)制，這有助于闡明機(jī)械拉伸產(chǎn)生的ERS條件下自噬與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Apoptosis 期刊題為“Dual role of endoplasmic reticulum stress-ATF-6 activation in autophagy and apoptosis induced by cyclic stretch in myoblast"。

首先，為了確認(rèn)機(jī)械拉伸對(duì)細(xì)胞活力的影響，將成肌細(xì)胞暴露于15% 伸長(zhǎng)率的循環(huán)機(jī)械拉伸下（每循環(huán)提供6 秒的機(jī)械拉伸）分別持續(xù)0、6、12和24小時(shí)，結(jié)果表明，機(jī)械拉伸顯著降低了細(xì)胞活力，呈時(shí)間依賴性抑制了成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)。接著采用TUNEL染色和AV/PI流式細(xì)胞術(shù)分析了機(jī)械拉伸的促凋亡作用，數(shù)據(jù)表明，成肌細(xì)胞的凋亡率隨著負(fù)荷時(shí)間逐漸升高，并在24 小時(shí)時(shí)達(dá)到最大值?；谶@些結(jié)果，得出結(jié)論，機(jī)械拉伸誘導(dǎo)成肌細(xì)胞凋亡是時(shí)間依賴性的。

為探究ERS對(duì)拉伸誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡的作用，采用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ERS標(biāo)志基因（GRP78、ATF-6、CHOP和Caspase-12）的表達(dá)。結(jié)果表明，ERS相關(guān)基因的mRNA水平隨著拉伸時(shí)間的增加而上調(diào)，并在24小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值（圖1 A）。用機(jī)械拉伸處理24 小時(shí)后，ER相關(guān)基因蛋白的表達(dá)水平與mRNA表達(dá)呈相似升高（圖1 B）。這說(shuō)明，循環(huán)拉伸激活ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖1    循環(huán)拉伸激活ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。（A）通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)GRP78，ATF-6，CHOP和Caspase-12的表達(dá)。（B）具有代表性的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示拉伸對(duì)GRP78，ATF-6，CHOP和Caspase-12 蛋白質(zhì)水平的影響。

接下來(lái)，為了闡明自噬在機(jī)械應(yīng)力下牙頜面肌肉重塑中的作用，實(shí)驗(yàn)使用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白（LC3-II、p62、Beclin1）的表達(dá)。結(jié)果表明，Beclin1和LC3-II在拉伸組中的表達(dá)呈時(shí)間依賴性顯著升高，而p62隨著拉伸時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。而且循環(huán)拉伸24 小時(shí)后，成肌細(xì)胞中雙膜自噬體的數(shù)量增加。LC3-II積累表明自噬體形成增加或自噬體-溶酶體融合受損。這些結(jié)果表明，機(jī)械拉伸處理后成肌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬。

為了進(jìn)一步證實(shí)ERS在拉伸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬中的作用，在成肌細(xì)胞中使用ERSS抑制劑4-PBA。ERS被4-PBA預(yù)處理抑制（圖2 A）。4-PBA成功降低了Beclin1的蛋白質(zhì)水平，拉伸誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞中的LC3II降低，但沒(méi)有降低p62（圖2 A）。如圖2 B所顯示，抑制ERS緩解拉伸誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡。此外，循環(huán)拉伸增加了紅色和黃色點(diǎn)狀體的百分比，而4-PBA處理抑制了此效果。這表明4-PBA處理顯著緩解了拉伸誘導(dǎo)的自噬（圖2 C）。這些結(jié)果表明，ERS參與拉伸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬。

圖2    ERS對(duì)拉伸誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡和自噬的作用。（A）在有或沒(méi)有4-PBA時(shí)機(jī)械拉伸下GRP78，ATF-6，CHOP，Bcl-2，LC3和Beclin1表達(dá)水平的蛋白質(zhì)印跡分析。 （B）進(jìn)行TUNEL染色以評(píng)估細(xì)胞凋亡水平。（C）在成肌細(xì)胞中進(jìn)行免疫熒光測(cè)定以確定自噬水平，并顯示LC3斑點(diǎn)的定量分析。

最后，為了進(jìn)一步闡明自噬的作用及其與ERS和細(xì)胞凋亡的關(guān)系，使用3-MA抑制成肌細(xì)胞的自噬。與單獨(dú)機(jī)械拉伸組相比，3-MA和機(jī)械拉伸的聯(lián)合處理顯著增強(qiáng)了CHOP的表達(dá)。同時(shí)，3-MA處理也增加了凋亡細(xì)胞的數(shù)量。然而，3-MA對(duì)ERS標(biāo)志物（GRP78和ATF-6）沒(méi)有明顯影響。此外，3-MA顯著增加了拉伸誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，自噬參與拉伸誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡，但可能對(duì)ERS沒(méi)有明顯影響。從圖2 A表明，4-PBA預(yù)處理顯著改善了成肌細(xì)胞中LC3II/I和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。然而，抑制自噬對(duì)ERS相關(guān)蛋白GRP78和ATF-6的表達(dá)沒(méi)有明顯影響。這意味著，循環(huán)拉伸暴露下自噬不是ERS 的原因。

上述結(jié)果表明，ATF-6可能在拉伸誘導(dǎo)的自噬和細(xì)胞凋亡中起重要作用。因此，為進(jìn)一步闡明其在機(jī)械拉伸誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡和自噬中的作用，創(chuàng)建了ATF-6沉默的成肌細(xì)胞，在循環(huán)拉伸之前用ATF-6 siRNA3轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞（圖3 A）。數(shù)據(jù)顯示，機(jī)械拉伸對(duì)成肌細(xì)胞的凋亡作用減弱（圖3 C）。敲低ATF-6可以顯著降低CHOP的水平，增加Bcl-2的水平，cleaved Caspase-12 表達(dá)無(wú)變化。這意味著，ATF-6通過(guò)循環(huán)拉伸處理的成肌細(xì)胞中的Bcl-2和CHOP通路在ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。這些結(jié)果表明，ATF-6通路在調(diào)節(jié)拉伸誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡和自噬過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

圖3    ATF-6在成肌細(xì)胞中拉伸誘導(dǎo)的自噬和凋亡中起重要的作用。

（A）蛋白質(zhì)印跡和實(shí)時(shí)PCR結(jié)果證實(shí)，在siRNA3轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞中，ATF-6水平被敲低最多。（B）蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染siRNA或不轉(zhuǎn)染siRNA后，拉伸成肌細(xì)胞中CHOP、 Cleaved Caspase-12、Bcl-2、LC3、Beclin1和p62的表達(dá)水平（C）通過(guò)膜聯(lián)蛋白V-FITC染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。（D）用mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染24小時(shí)，轉(zhuǎn)染siRNA或不轉(zhuǎn)染siRNA后，免疫熒光測(cè)定成肌細(xì)胞中的自噬。

綜上所述，這項(xiàng)研究表明，成肌細(xì)胞在體外經(jīng)歷循環(huán)拉伸，并通過(guò)凋亡和自噬方式對(duì)機(jī)械拉伸做出反應(yīng)，這與ATF-6介導(dǎo)的ERS通路密切相關(guān)。在機(jī)械拉伸下，自噬被誘導(dǎo)。這削弱了成肌細(xì)胞凋亡的過(guò)程，這已被確定為防止細(xì)胞死亡的作用。該研究解釋了ATF-6通路在拉伸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬的分子機(jī)制中的作用，確保了對(duì)功能性器具影響成肌細(xì)胞的機(jī)制有充分的了解。然而，在拉伸刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡和自噬之間發(fā)生的串?dāng)_需要進(jìn)一步闡明。因此，未來(lái)的研究可以闡明ERS，細(xì)胞凋亡和自噬參與拉伸成肌細(xì)胞的確切相互作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Zhang Q, Liu G, Liu R, Liu J, Zeng X, Ren D, Yan X, Yuan X. Dual role of endoplasmic reticulum stress-ATF-6 activation in autophagy and apoptosis induced by cyclic stretch in myoblast. Apoptosis. 2023 Jun;28(5-6):796-809. doi: 10.1007/s10495-023-01825-5. Epub 2023 Mar 7. Erratum in: Apoptosis. 2023 Jul 13;: PMID: 36881290.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36881290/

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