髓核（NP）組織是一種凝膠狀組織，主要由II型膠原蛋白和蛋白聚糖組成。髓核細(xì)胞（NPC）負(fù)責(zé)合成細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分（主要是II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖），在椎間盤(pán)（IVD）退變過(guò)程中首先表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡和/或衰老樣變化。在椎間盤(pán)退變中，衰老的NP細(xì)胞積聚并導(dǎo)致增殖減弱，自我修復(fù)受損，細(xì)胞功能下降以及功能性ECM破壞加劇。因此，治療IVD退變的潛在策略是通過(guò)調(diào)節(jié)退變過(guò)程中涉及的潛在信號(hào)分子或通路來(lái)減輕或延緩NP細(xì)胞的凋亡和/或衰老樣變化。

通常認(rèn)為，施加在IVD上的超負(fù)荷壓縮力是導(dǎo)致IVD退變的主要原因。既往研究表明，由于刺激蛋白聚糖合成，生理強(qiáng)度的壓縮負(fù)荷（0.35-0.75 MPa）可作為NP和AF（纖維環(huán)）細(xì)胞的合成代謝因子。相反，過(guò)度壓縮（≥ 1 MPa）加重了NP和AF細(xì)胞蛋白聚糖的分解代謝。盡管NP細(xì)胞壓縮負(fù)荷相關(guān)生物行為變化的分子機(jī)制尚不清楚，但大多數(shù)研究指出，超負(fù)荷壓縮誘導(dǎo)的NP細(xì)胞凋亡和衰老變化與機(jī)械敏感因子（如整合素和鈣粘蛋白）觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)氧化損傷有關(guān)。因此，探索NP細(xì)胞壓縮相關(guān)生物學(xué)變化中潛在的生物調(diào)節(jié)因子和信號(hào)通路具有重要意義。

在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院骨科及附屬第一醫(yī)院泌尿外科、九龍坡區(qū)第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，以人NP細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用自主研發(fā)的壓縮負(fù)荷生物反應(yīng)器，分析了NP細(xì)胞的凋亡和衰老樣變化；并進(jìn)一步使用基于串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（TMT-）的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析了在非壓縮，低壓縮力（LC）和高壓縮力（HC）負(fù)荷培養(yǎng)下的不同NP細(xì)胞之間的差異表達(dá)蛋白（DEPs），其中巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）和氧化應(yīng)激相關(guān)通路在體內(nèi)和體外進(jìn)一步評(píng)估；還建立了MIF敲除（MIF-KO）NP細(xì)胞，以進(jìn)一步確定MIF在經(jīng)歷超負(fù)荷壓縮的NP細(xì)胞中的保護(hù)功能。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Oxidative Medicine and Cellular Longevity 期刊題為“Deficiency of MIF Accentuates Overloaded Compression-Induced Nucleus Pulposus Cell Oxidative Damage via Depressing Mitophagy"。

該團(tuán)隊(duì)之前的研究證實(shí)，機(jī)械壓縮誘導(dǎo)的水凝膠變形可以有效地模擬NP細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的體內(nèi)負(fù)荷情況。因此，此次研究培養(yǎng)了NP細(xì)胞包裹的GelMA水凝膠，并使用自主開(kāi)發(fā)的壓縮負(fù)荷生物反應(yīng)器提供間歇壓縮負(fù)荷，以0%、5%、10% 和20% 的壓縮變形施加仿生壓縮力（1.0 Hz，4小時(shí)/天），處理樣本分三組：對(duì)照組-0%、LC負(fù)荷組-5%變形、HC負(fù)荷組-20%變形。

首先，研究了梯度機(jī)械壓縮對(duì)人 NP 細(xì)胞的細(xì)胞衰老、活力和 ECM 合成的影響。結(jié)果顯示，HC組（變形≥10%）陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增加，而LC組（變形≤5%）無(wú)明顯變化。熒光活/死染色結(jié)果也表明，超過(guò)10% 的壓縮變形顯著提高了NP細(xì)胞的死亡率，而LC組并無(wú)變化。檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果表明，HC組NP細(xì)胞的凋亡明顯增強(qiáng)，LC組則無(wú)變化。此外，衰老相關(guān)標(biāo)志物（P53、P21和P16）在遭受HC負(fù)荷的NP細(xì)胞中強(qiáng)烈過(guò)表達(dá)，而功能性ECM成分（聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白）的合成受到HC負(fù)荷的顯著抑制，但在LC組中沒(méi)有。

為了進(jìn)一步分析壓縮相關(guān)的NP細(xì)胞存活和衰老過(guò)程中的潛在功能因素，采用基于TMT的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，分別評(píng)估了對(duì)照組、LC負(fù)荷組和HC負(fù)荷組的DEPs （圖1）。根據(jù)三組對(duì)比結(jié)果，推測(cè)LC負(fù)荷組中過(guò)表達(dá)的蛋白與HC負(fù)荷組中低表達(dá)的蛋白的交集可能是NP細(xì)胞存活的保護(hù)因子。相反，LC負(fù)荷組中低表達(dá)的蛋白與HC負(fù)荷組中過(guò)表達(dá)的蛋白的交集可能是NP細(xì)胞存活的不利因素。因此，進(jìn)一步分析了蛋白質(zhì)簇，并預(yù)測(cè)了NP細(xì)胞存活的8個(gè)潛在保護(hù)因子和3個(gè)潛在有害因子。在8個(gè)潛在的保護(hù)因子中，MIF 因其在調(diào)節(jié)椎間軟骨終板（CEP）細(xì)胞命運(yùn)中的作用而被選中進(jìn)行進(jìn)一步的研究。此外，GO和KEGG富集分析表明，壓縮負(fù)荷通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)通路（ATP生物合成過(guò)程和氧化磷酸化）影響NP細(xì)胞的命運(yùn)。

圖1    TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)程序的流程示意圖：NP細(xì)胞包裹的水凝膠在0%（對(duì)照）、5% 變形（低壓縮負(fù)荷）和20% 變形（高壓縮負(fù)荷）的動(dòng)態(tài)壓縮下培養(yǎng)2周，蛋白質(zhì)提取物用10-plex TMT試劑標(biāo)記，通過(guò)LC-MS/MS分析多肽。

接下來(lái)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證MIF表達(dá)與壓縮負(fù)荷相關(guān)的NP退變之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)建立了大鼠尾部IVD超負(fù)荷壓縮模型（圖2 a）來(lái)檢測(cè)其對(duì)大鼠尾部NP組織生物學(xué)行為及MIF表達(dá)的影響。根據(jù)先前的研究，從遠(yuǎn)端施加軸向力產(chǎn)生1.3 MPa的壓縮負(fù)荷，然后根據(jù)壓縮持續(xù)時(shí)間將大鼠分為三組：假手術(shù)組、2周負(fù)荷組、4周負(fù)荷組。壓縮大鼠尾部IVD的圖像表明，NP組織在2周的超負(fù)荷壓縮下出現(xiàn)退變跡象，在4周的超負(fù)荷壓縮下惡化（圖2 b、c）。此外，HE染色的形態(tài)學(xué)分析還顯示壓縮大鼠尾部IVD在2周和4周內(nèi)出現(xiàn)中度和重度退行性體征（NP丟失和AF纖維軟骨薄片波紋增加）（圖2 d、e）。阿利新藍(lán)染色結(jié)果還顯示，隨著IVD壓縮時(shí)間的延長(zhǎng)，糖胺聚糖的含量逐漸下降（圖2 f、g）。值得注意的是，MIF表達(dá)在遭受2周壓縮的中度退行性NP中上調(diào)，但在遭受4周壓縮的嚴(yán)重退行性NP中下調(diào)（圖2 h、i）。

圖2   超負(fù)荷壓縮對(duì)大鼠尾部NP生物學(xué)行為及MIF表達(dá)的影響。

基于蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，通過(guò)分析氧化應(yīng)激相關(guān)生物標(biāo)志物，進(jìn)一步明確MIF相關(guān)NP退行性變化的分子機(jī)制。在分析氧化應(yīng)激相關(guān)生物標(biāo)志物之前，敲除內(nèi)源性MIF（MIF-KO）不影響NP細(xì)胞的衰老速度，但HC負(fù)荷顯著加重了NP細(xì)胞的衰老，而MIF-KO進(jìn)一步加劇了HC負(fù)荷誘導(dǎo)的NP細(xì)胞衰老。然后分析了NP細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)ROS含量，結(jié)果表明，單獨(dú)敲除MIF不會(huì)誘導(dǎo)ROS的積累。然而，HC負(fù)荷確實(shí)增加了NP細(xì)胞中ROS的含量，并且MIF-KO顯著增加了HC負(fù)荷處理的NP細(xì)胞中ROS的含量。此外，MIF-KO顯著消除了MIF的表達(dá)，但衰老相關(guān)標(biāo)志物（P53、P21和P16）和氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物（NT）的表達(dá)不受MIF-KO的影響。與對(duì)照組相比，HC負(fù)荷降低了MIF的表達(dá)，顯著增強(qiáng)了P53、P21、P16和NT的表達(dá)。同樣，HC負(fù)荷處理的NP細(xì)胞中MIF的敲除進(jìn)一步加劇了衰老相關(guān)和氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，MIF的缺失加劇了遭受超負(fù)荷壓縮的人類(lèi)NP細(xì)胞中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老。

線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和形成ATP的主要場(chǎng)所，也是ROS的主要產(chǎn)生部位。之前的研究證實(shí)，線(xiàn)粒體自噬可以通過(guò)回收受損的線(xiàn)粒體來(lái)緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的NP細(xì)胞衰老。因此，實(shí)驗(yàn)最后在當(dāng)前研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察了線(xiàn)粒體自噬相關(guān)的標(biāo)記。

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，MIF-KO和HC處理均能下調(diào)PINK1和LC3II/I的表達(dá)，上調(diào)Parkin 和P62的表達(dá)，這是線(xiàn)粒體自噬阻斷的標(biāo)志（圖3 a、b）。值得注意的是，HC處理的NP細(xì)胞中MIF的敲除進(jìn)一步加劇了線(xiàn)粒體自噬相關(guān)標(biāo)志物的抑制（圖3 a、b）。JC-1染色結(jié)果表明，單獨(dú)敲除MIF不會(huì)引起線(xiàn)粒體損傷，但HC負(fù)荷加重了NP細(xì)胞線(xiàn)粒體損傷（圖3 c、d）。此外，HC處理的MIF-KO NP細(xì)胞具有最高的JC-1綠/紅色熒光比，表明MIF的缺失加劇了HC負(fù)荷誘導(dǎo)的受損線(xiàn)粒體的積累（圖3 c、d）。

為了進(jìn)一步研究不同階段的線(xiàn)粒體自噬，用編碼GFP-LC3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NP細(xì)胞，分別標(biāo)記自噬體和線(xiàn)粒體，觀察NP細(xì)胞中線(xiàn)粒體和自噬體的數(shù)量和形態(tài)。對(duì)照組和MIF-KO組NP細(xì)胞的線(xiàn)粒體保持正常的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，而在HC負(fù)荷處理的NP細(xì)胞中，線(xiàn)粒體明顯wei;suo，膜密度增加。此外，HC負(fù)荷的細(xì)胞在其細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)出更多的自噬體，而用HC負(fù)荷的MIF-KO NP細(xì)胞在其細(xì)胞質(zhì)中沒(méi)有出現(xiàn)典型的自噬體。上述結(jié)果表明，MIF的缺失確實(shí)延緩了NP細(xì)胞的線(xiàn)粒體自噬，從而加劇了超負(fù)荷壓縮下氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的NP細(xì)胞的衰老。

圖3   MIF-KO加劇氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的NP細(xì)胞衰老和線(xiàn)粒體功能障礙。

圖4    MIF調(diào)控超負(fù)荷壓縮誘導(dǎo)的NP細(xì)胞衰老的潛在機(jī)制：超負(fù)荷壓縮誘導(dǎo)線(xiàn)粒體損傷，觸發(fā)NP細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)衰老。MIF的缺失抑制了NP細(xì)胞的線(xiàn)粒體自噬，這進(jìn)一步加劇了超負(fù)荷壓縮力下NP細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)的衰老。

總之，該研究表明，超負(fù)荷的機(jī)械壓縮會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)NP細(xì)胞的氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體功能障礙和退行性變化。相反，適當(dāng)?shù)纳韷嚎s力有利于維持NP的細(xì)胞活力和ECM穩(wěn)態(tài)。此外，MIF表達(dá)與NP細(xì)胞的機(jī)械壓縮力相關(guān)的生物學(xué)變化之間存在一定的關(guān)系。MIF的缺失加劇了超負(fù)荷機(jī)械壓縮下ROS的積累，線(xiàn)粒體功能障礙和衰老。該過(guò)程涉及的潛在分子機(jī)制與MIF的線(xiàn)粒體自噬誘導(dǎo)作用有關(guān)。該研究有助于我們更好地理解機(jī)械壓縮應(yīng)力在椎間盤(pán)退變過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用，為使用MIF治療椎間盤(pán)退行性疾病提供了更有力的證據(jù)。

參考文獻(xiàn)：Wang Y, Hu Y, Wang H, Liu N, Luo L, Zhao C, Zhou D, Tong H, Li P, Zhou Q. Deficiency of MIF Accentuates Overloaded Compression-Induced Nucleus Pulposus Cell Oxidative Damage via Depressing Mitophagy. Oxid Med Cell Longev. 2021 Jul 1;2021:6192498. doi: 10.1155/2021/6192498. PMID: 34306312; PMCID: PMC8270705.

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