乳腺腫瘤微環(huán)境（TME）內(nèi)的機(jī)械力是癌癥進(jìn)展的有效調(diào)節(jié)因子。隨著乳腺腫瘤的生長(zhǎng)，各種生物力學(xué)在TME中積累，造成了腫瘤內(nèi)部的壓縮增加，外圍張力增加以及整個(gè)腫瘤體積的間質(zhì)液流動(dòng)改變的復(fù)雜情況，這些力通過(guò)調(diào)控侵襲和轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)影響癌癥進(jìn)展。此外，研究表明，生物力學(xué)力通過(guò)癌細(xì)胞-免疫細(xì)胞信號(hào)串?dāng)_調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

盡管TME內(nèi)存在多種細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，但外泌體在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞免疫逃逸，從而促進(jìn)易于腫瘤發(fā)展的環(huán)境。此外，研究表明，生物力學(xué)力可能具有通過(guò)TME內(nèi)外泌體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)直接或間接調(diào)節(jié)細(xì)胞成分的潛力。

有幾種仿生體外系統(tǒng)可用于確定機(jī)械力對(duì)癌細(xì)胞的影響。微流體和Transwell系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)趨化因子和蛋白質(zhì)表達(dá)提供了對(duì)血流介導(dǎo)的乳腺癌（BCa）細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的見(jiàn)解。其他采用壓縮的體外系統(tǒng)已顯示，BCa細(xì)胞響應(yīng)壓縮力通過(guò)細(xì)胞骨架重排增強(qiáng)其遷移。恒定張力下的三陰性乳腺癌（TNBC）細(xì)胞系通過(guò)FAK-Rho-ERK介導(dǎo)的信號(hào)增強(qiáng)其增殖和侵襲潛力。雖然這些體外研究已經(jīng)解決了恒定流量或恒定細(xì)胞張力如何直接影響癌細(xì)胞，但尚未解決這些機(jī)械力是否有助于體內(nèi)免疫抑制。此外，惡性BCa細(xì)胞中的機(jī)械力，外泌體釋放和免疫反應(yīng)之間的直接聯(lián)系尚未得到研究。

來(lái)自美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校醫(yī)學(xué)系、病理學(xué)系、機(jī)械工程系課題組的一項(xiàng)研究曾報(bào)告了機(jī)械應(yīng)變能明顯改變BCa細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)特征并能增強(qiáng)外泌體的產(chǎn)生，所產(chǎn)生的外泌體能夠直接促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制及改變免疫細(xì)胞的極化。相關(guān)研究成果發(fā)表在Laboratory Investigation期刊，題為“Mechanical strain induces phenotypic changes in breast cancer cells and promotes immunosuppression in the tumor microenvironment"。

振蕩應(yīng)變促進(jìn)BCa細(xì)胞增殖和遷移

首先，為了確定體外機(jī)械應(yīng)變是否調(diào)節(jié)BCa細(xì)胞的增殖，利用體外張力系統(tǒng)，參數(shù)為0.3 Hz，10%單軸振蕩應(yīng)變（Oscillatory strain，OS） 48小時(shí)，10% 恒定應(yīng)變（Constant strain，CS）48小時(shí)，或無(wú)應(yīng)變48小時(shí)，然后將MCF-7細(xì)胞（人ER+），MDA-MB-231細(xì)胞（人TNBC）和4T1.2細(xì)胞（小鼠TNBC）暴露于恒定或振蕩應(yīng)變，并評(píng)估細(xì)胞增殖。結(jié)果表明，暴露于OS的MCF-7細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞或CS細(xì)胞相比增殖增加（圖1 a）。與對(duì)照細(xì)胞相比，暴露于CS和OS下的MDA-MB-231和4T1.2細(xì)胞的增殖都有所增加（圖1 b-c）；暴露于OS增強(qiáng)了ER+和TNBC（人和小鼠）細(xì)胞的遷移潛力（圖1 d-f）；暴露于CS僅增加人TNBC細(xì)胞的Transwell遷移和傷口愈合（圖1 e）。這些數(shù)據(jù)表明，振蕩應(yīng)變促進(jìn)ER+和TNBC細(xì)胞的增殖和遷移。

圖1   BCa細(xì)胞的增殖和遷移響應(yīng)機(jī)械應(yīng)變而變化。

機(jī)械應(yīng)變改變BCa細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體

為了研究機(jī)械應(yīng)變是否調(diào)節(jié)BCa細(xì)胞的外泌體產(chǎn)生，將MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞和4T1.2細(xì)胞暴露于OS 48小時(shí)，并從條件培養(yǎng)基中分離腫瘤來(lái)源的外泌體（TEXs）。 結(jié)果表明，OS暴露的人和小鼠TNBC細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的外泌體濃度顯著高于對(duì)照細(xì)胞，而OS不會(huì)改變ER+ 細(xì)胞的TEX產(chǎn)生，而且外泌體之間的平均大小在組間沒(méi)有顯著差異。此外，外泌體濃度與暴露于OS后在人和小鼠TNBC細(xì)胞中觀察到的增殖增加呈正相關(guān)。

目前尚不清楚增加的外泌體產(chǎn)量是否導(dǎo)致更高的增殖，或者更高的增殖是否導(dǎo)致外泌體的產(chǎn)生增加。為了解決這個(gè)問(wèn)題，進(jìn)行了共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，將暴露或不暴露于OS 48小時(shí)的 MCF-7細(xì)胞，MDA-MB-231細(xì)胞和4T1.2細(xì)胞在存在或不存在源自癌細(xì)胞外泌體的情況下共培養(yǎng)，評(píng)估細(xì)胞增殖。結(jié)果沒(méi)有觀察到與來(lái)自對(duì)照細(xì)胞的外泌體共培養(yǎng)和與來(lái)自暴露于OS癌細(xì)胞的外泌體共培養(yǎng)之間的癌細(xì)胞增殖顯著差異。因此，外泌體產(chǎn)生的增加不會(huì)導(dǎo)致更高的增殖，這表明更高的增殖可能導(dǎo)致研究中注意到的外泌體產(chǎn)生的增加。

振蕩應(yīng)變改變BCa細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)外泌體譜

Tetraspanins、CD63、CD81、CD9 和 ESCRT-I 復(fù)合物亞基TSG101 是gongren的標(biāo)志物，可共同識(shí)別來(lái)自其他類型細(xì)胞外囊泡（EVs）的外泌體。暴露于OS的MCF-7細(xì)胞釋放的TEXs的表征顯示CD63+ 外泌體的頻率增加，CD81+ 外泌體的頻率降低。人和小鼠TNBC細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體的Tetraspanin譜沒(méi)有顯著變化。此外，免疫調(diào)節(jié)蛋白（如免疫檢查點(diǎn)PD-L1）和賦予外泌體侵襲潛力的蛋白（如EpCAM和CD54）在外泌體上的存在開(kāi)始在促進(jìn)免疫抑制、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面受到重視。當(dāng)評(píng)估這些標(biāo)志物時(shí)，暴露于OS的小鼠4T1.2細(xì)胞CD81+ PD-L1+ 和CD63+ PD-L1+ 外泌體的數(shù)量增加，而CD63+ CD54+ 外泌體的數(shù)量降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，振蕩應(yīng)變調(diào)節(jié)TNBC細(xì)胞產(chǎn)生PD-L1+ 外泌體。

振蕩應(yīng)變促進(jìn)TNBC原位模型中的腫瘤生長(zhǎng)

接下來(lái)，為了確定OS是否促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，利用BCa的同源原位小鼠模型來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤大小和免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。如圖2 a，與移植未應(yīng)變的細(xì)胞相比，移植4T1.2細(xì)胞的小鼠暴露于OS在第8天和第11天顯示腫瘤生長(zhǎng)顯著增加。

由于異質(zhì)性髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞具有腫瘤促進(jìn)功能，并且是腫瘤相關(guān)免疫抑制的驅(qū)動(dòng)因素，因此進(jìn)一步研究了機(jī)械應(yīng)變誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞變化是否改變了乳腺TME以調(diào)節(jié)這些免疫抑制細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤組織的免疫分析顯示，移植4T1.2細(xì)胞的小鼠暴露于OS在第14天TME中單核細(xì)胞MDSC亞群的百分比顯著增加（圖2 b）。腫瘤浸潤(rùn)性粒細(xì)胞在兩組間的 MDSC 亞群無(wú)差異（圖2 c）。此外，移植4T1.2細(xì)胞的小鼠暴露于OS后TME中募集的巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)增加（圖2 d）。值得注意的是，CD8+ T細(xì)胞的百分比在這些小鼠的TME中顯示出下降的趨勢(shì)（圖2 e）。這些結(jié)果表明，振蕩應(yīng)變通過(guò)TME中的免疫抑制促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

圖2   振蕩力促進(jìn)體內(nèi)TME中的腫瘤生長(zhǎng)和免疫抑制。

振蕩應(yīng)變通過(guò)TME中的免疫抑制細(xì)胞調(diào)節(jié)外泌體的內(nèi)化

然后進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體是否被免疫細(xì)胞內(nèi)化以調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫抑制。結(jié)果表明，在乳腺腫瘤細(xì)胞上應(yīng)用OS不僅可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞-外泌體的分泌，還可以通過(guò)MDSCs和募集的巨噬細(xì)胞內(nèi)化TEXs促進(jìn)MDSCs和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而調(diào)節(jié)TME中的免疫抑制。

TME中免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的外泌體內(nèi)化

最后研究了TEXs是否被TME中的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞內(nèi)化。在注射外泌體后的第2天（圖3 a）和第8天（圖3 a），TME中免疫細(xì)胞內(nèi)化的外泌體被鑒定為PKH67+ CD45+ 細(xì)胞，而腫瘤細(xì)胞內(nèi)化的外泌體被鑒定為PKH67+ CD45 陰性細(xì)胞（圖3 b）。此外，在外泌體注射后第2天和第8天，在TME中檢測(cè)到各種免疫細(xì)胞的外泌體內(nèi)化，包括募集的巨噬細(xì)胞（圖3 c）、M2巨噬細(xì)胞（圖3 d）、MDSCs（圖3 e-g）、 CD4+ T 細(xì)胞 （圖3 h）和CD8+ T細(xì)胞（圖3 i）。在外泌體+ 細(xì)胞中，MDSCs的頻率高于其他研究的免疫細(xì)胞群。這些結(jié)果表明，TEXs可以被TME中的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)內(nèi)化。

圖3    TME中免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞內(nèi)化外泌體。

總之，該研究的數(shù)據(jù)表明，暴露于機(jī)械應(yīng)變會(huì)增強(qiáng)BCa細(xì)胞中的侵襲性和促腫瘤表型，從而通過(guò)改變腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移潛力以及增加免疫抑制細(xì)胞內(nèi)化的免疫調(diào)節(jié)外泌體的釋放來(lái)促進(jìn)免疫抑制，從而促進(jìn)TME中增強(qiáng)的免疫-腫瘤細(xì)胞串?dāng)_。進(jìn)一步研究參與腫瘤進(jìn)展的機(jī)械應(yīng)力的潛在機(jī)制的努力可能為靶向TME提供新的治療方法。

參考文獻(xiàn)：Wang Y, Goliwas KF, Severino PE, Hough KP, Van Vessem D, Wang H, Tousif S, Koomullil RP, Frost AR, Ponnazhagan S, Berry JL, Deshane JS. Mechanical strain induces phenotypic changes in breast cancer cells and promotes immunosuppression in the tumor microenvironment. Lab Invest. 2020 Dec;100(12):1503-1516. doi: 10.1038/s41374-020-0452-1. Epub 2020 Jun 22. PMID: 32572176; PMCID: PMC7686122.

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