人類牙周韌帶來源的干細(xì)胞（PDLSCs）是牙周韌帶（PDL）中的主要功能性骨祖細(xì)胞，通過機(jī)械傳感和信號傳導(dǎo)參與適應(yīng)性活動。目前對調(diào)節(jié)PDLSCs中成骨活性的機(jī)械力誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)的研究已經(jīng)獲得了進(jìn)展。然而，關(guān)于將外在機(jī)械應(yīng)力與內(nèi)在生化反應(yīng)聯(lián)系起來的機(jī)械傳感器的知識是有限的。

盡管在機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些用于控制成骨的膜嵌入蛋白，但許多位于或橫跨細(xì)胞膜上的感覺元件仍有待定義。LRP6是一種Wnt跨膜受體，通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路在細(xì)胞機(jī)械傳感中發(fā)揮一系列重要作用。最近，LRP6被發(fā)現(xiàn)是參與牙齒發(fā)育、少牙畸形和口腔鱗狀細(xì)胞癌等牙齒生理和病理活動的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此，推測PDLSCs中的LRP6是一種候選響應(yīng)傳感器，可響應(yīng)機(jī)械應(yīng)力并介導(dǎo)成骨作用。

基于此，山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔正畸科、山東省口腔組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等聯(lián)合團(tuán)隊的一項研究旨在闡明在正畸牙齒移動（OTM）期間機(jī)械誘導(dǎo)的PDLSCs中調(diào)節(jié)成骨活動的關(guān)鍵傳感器機(jī)械信號。

LRP6在機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs和PDL組織中的表達(dá)增強(qiáng)

在體外，將培養(yǎng)的細(xì)胞暴露于循環(huán)拉伸應(yīng)力（CSS，10% 伸長率，0.5 Hz）中6，12和24小時，模擬體內(nèi)機(jī)械力負(fù)荷。與無拉伸組相比，LRP6的表達(dá)呈時間依賴性上調(diào)，拉伸24 h上調(diào)最為明顯。磷酸化的LRP6（P-LRP6）表現(xiàn)出相同的趨勢。CSS加載上調(diào)了P-LRP6/總LRP6的蛋白質(zhì)水平比值，且在24 h觀察到zui顯著的變化。免疫熒光證實(shí)，拉伸24 h 后LRP6顯著升高。因此，后續(xù)的研究中采用了拉伸24小時。

這些數(shù)據(jù)表明，LRP6可能與PDLSCs對機(jī)械力的響應(yīng)有關(guān)。此外，HE染色顯示PDL組織張力側(cè)的體內(nèi)分散。實(shí)驗(yàn)觀察到LRP6表達(dá)分布在整個牙周組織中，其表達(dá)從第0-7天逐漸上調(diào)。第14天LRP6表達(dá)量較第3天和第7天下降。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步暗示LRP6可能參與OTM期間的牙槽骨重塑。

LRP6失活抑制了機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs中的成骨作用

LRP6在機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs中的表達(dá)升高，伴隨著增殖和成骨能力的提高，表現(xiàn)為增殖標(biāo)志物（PCNA）和成骨標(biāo)志物（ALP和RUNX2）的表達(dá)顯著增加（圖1 a、b）。接下來，實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建慢病毒載體抑制LRP6表達(dá)，以闡明LRP6在PDLSCs中機(jī)械力依賴性成骨性能中的作用。拉伸6 h后，sh-LRP6組P-LRP6和LRP6的蛋白水平顯著下調(diào)（圖1 c）。LRP6的mRNA表達(dá)也發(fā)生相同變化（圖1 d），且sh-LRP6組中P-LRP6/總LRP6的比例升高，表明與總蛋白相比磷酸化下降趨勢較慢（圖1 e）。此外，LRP6敲低減弱了增殖標(biāo)志物（PCNA）和成骨標(biāo)志物（ALP，RUNX2，OSX）的表達(dá)（圖1 f、g）。同時，在sh-LRP6組中Ki-67陽性細(xì)胞的比例顯著下降（圖1 h、i），ALP染色顯著減弱（圖1 j），ALP活性顯著降低（圖1 k），驗(yàn)證了LRP6缺失細(xì)胞的增殖和成骨能力降低。這些數(shù)據(jù)表明，LRP6參與調(diào)節(jié)PDLSCs的機(jī)械力依賴性增殖和成骨分化。

圖1   LRP6失活抑制了機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSC中的成骨作用。

LRP6失活破壞了機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs中的F-肌動蛋白動力學(xué)

令人驚訝的是，在sh-LRP6組中觀察到細(xì)胞面積和形態(tài)的異常變化，其中LRP6缺失細(xì)胞在拉伸24 h后接觸面積明顯增大，細(xì)胞圓度變小，寬長比降低。肌動蛋白細(xì)胞骨架重排對于維持機(jī)械力誘導(dǎo)的細(xì)胞形狀是必要的。因此，實(shí)驗(yàn)假設(shè)LRP6是機(jī)械力誘導(dǎo)PDLSCs中F-肌動蛋白動力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。實(shí)際上，在CSS下的sh-LRP6組中β-肌動蛋白單體合成和F-肌動蛋白聚合受到嚴(yán)重抑制。在機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs中，F(xiàn)-肌動蛋白動力學(xué)所需的F-肌動蛋白上游調(diào)節(jié)因子（RHOA和ROCK1）的表達(dá)也顯著降低。此外，在 CSS 下的 sh-LRP6 組中 F-肌動蛋白定向紊亂且明顯拉長，連續(xù)性也顯然被破壞。LRP6缺失細(xì)胞中F-肌動蛋白密度也顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，激活LRP6促進(jìn)了機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs中的F-肌動蛋白動力學(xué)，并可能在OTM期間促進(jìn)PDL組織的結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)。

破壞F-肌動蛋白動力學(xué)抑制了機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs中的成骨作用

然后實(shí)驗(yàn)研究了LRP6介導(dǎo)的F-肌動蛋白動力學(xué)是否參與機(jī)械力依賴性成骨作用。首先在力誘導(dǎo)的PDLSCs和PDL組織中檢測到β-肌動蛋白表達(dá)。與LRP6表達(dá)模式一致的β-肌動蛋白的表達(dá)從第0-7天顯示出顯著的積累，并在體內(nèi)第14天略有下降（圖2 a、b），但在體外拉伸后穩(wěn)定升高（圖2 c-e）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)，PDLSCs中的LRP6的缺失破壞了機(jī)械力誘導(dǎo)的F-肌動蛋白組裝。

接下來，使用有效的肌動蛋白聚合抑制劑Cyto D研究了F-肌動蛋白動力學(xué)對PDLSCs中機(jī)械力依賴性成骨性能的作用。如圖2 f、g 所示，Cyto D抑制ALP、RUNX2、OSX和PCNA的表達(dá)，同時抑制β-肌動蛋白的表達(dá)。然后，Cyto D引起的Ki-67陽性細(xì)胞比例的顯著降低（圖2 h）和ALP染色的弱化（圖2 i），驗(yàn)證了由于F-肌動蛋白動力學(xué)破壞而導(dǎo)致PDLSCs中力依賴性成骨作用的減弱能力。因此，實(shí)驗(yàn)確定F-肌動蛋白是LRP6信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵下游分支，調(diào)節(jié)PDLSCs中機(jī)械力依賴性的成骨作用。

圖2   破壞的F-肌動蛋白動力學(xué)抑制了力誘導(dǎo)的PDLSC中的成骨作用。

LRP6/F-肌動蛋白軸調(diào)節(jié)機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs中YAP核易位和激活

YAP通過穿梭進(jìn)入細(xì)胞核起作用，是PDLSCs中機(jī)械力依賴性成骨作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄介質(zhì)。研究人員推測YAP作為與LRP6 / F-肌動蛋白軸信號協(xié)調(diào)的關(guān)鍵傳感器，最終有助于PDLSCs中的力依賴性成骨作用。因此，首先研究了LRP6表達(dá)與YAP定位、磷酸化和轉(zhuǎn)錄活性之間的關(guān)系。LRP6敲低將核YAP重新定位到細(xì)胞質(zhì)，盡管YAP在CSS加載后主要集中在細(xì)胞核中（圖3 a、b）。同時，觀察到LRP6敲低誘導(dǎo)YAP磷酸化（圖3 c、d）。值得注意的是，YAP靶基因在LRP6缺失細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低（圖3 e）。此外，Cyto D還將核YAP重新定位到機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs中的細(xì)胞質(zhì)上（圖3 f、g），且誘導(dǎo)YAP磷酸化（圖3 h、i），降低YAP靶基因表達(dá)（圖3 j）。這些數(shù)據(jù)表明，PDLSCs中的LRP6敲低干擾了F-肌動蛋白動力學(xué)，進(jìn)一步調(diào)控YAP核易位和隨后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（圖4）。

圖3   LRP6 / F-肌動蛋白軸調(diào)節(jié)機(jī)械力誘導(dǎo)PDLSC中的YAP核易位和活化。

圖4   所提出機(jī)制的示意圖。

在由正畸應(yīng)用引起的牙槽骨重塑過程中，機(jī)械力增強(qiáng)了PDLSCs中的LRP6膜定位。隨后LRP6動員促進(jìn)F-肌動蛋白聚合和重排，并進(jìn)一步促進(jìn)YAP穿梭到細(xì)胞核?；罨腨AP隨后促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨分化，最終導(dǎo)致新的骨形成。

綜上所述，這項研究揭示了一種du'te的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，用于控制成骨性能，以LRP6為中心，將機(jī)械線索連接到機(jī)械力誘導(dǎo)的PDLSCs中的F-肌動蛋白/ YAP級聯(lián)。這些結(jié)果揭示了OTM的分子基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：Wang J, Yang H, Ma X, Liu J, Li L, Chen L, Wei F. LRP6/filamentous-actin signaling facilitates osteogenic commitment in mechanically induced periodontal ligament stem cells. Cell Mol Biol Lett. 2023 Jan 24;28(1):7. doi: 10.1186/s11658-023-00420-5. PMID: 36694134; PMCID: PMC9872397.

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