椎間盤退行性病變（DDD）是腰痛的重要病因。DDD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括機(jī)械負(fù)荷過大、創(chuàng)傷、炎癥、遺傳、衰老、肥胖、營養(yǎng)不良等。椎間盤（IVD）纖維環(huán)（AF）的物理損傷是脊柱退行性改變的重要原因。過度的機(jī)械拉伸會(huì)改變AF細(xì)胞的數(shù)量和表型，從而降低AF的彈性，導(dǎo)致IVD進(jìn)一步損傷和退化。此外，AF細(xì)胞具有祖細(xì)胞的特性，可以在體外和體內(nèi)分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。因此，研究AF細(xì)胞上成骨的信號(hào)通路對(duì)于闡明DDD的發(fā)病機(jī)制非常重要。

BMPs（人骨形態(tài)發(fā)生蛋白）是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族的成員，具有誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞并促進(jìn)骨形成的潛力。BMP-2及其I型和II型受體的表達(dá)已在小鼠IVD的纖維細(xì)胞中觀察到。BMP-2/4及其I型和II型受體在50周齡衰老加速小鼠AF內(nèi)的纖維軟骨細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，因此似乎與IVD的變性有關(guān)。到目前為止，許多研究已經(jīng)使用包含兩個(gè)BMP基因的異源二聚體配體來闡明BMP異源二聚體的廣泛生物學(xué)作用，并且不同BMP配體的共表達(dá)可導(dǎo)致異源二聚體配體的形成。然而，BMP-2/6異源二聚體在IVD變性的發(fā)病機(jī)制中的作用尚未得到很好的研究。

因此，國立嘉義大學(xué)生化科學(xué)與技術(shù)系及食品科學(xué)系、成功大學(xué)醫(yī)院附設(shè)醫(yī)院骨科的一項(xiàng)聯(lián)合研究的目的是確定BMP-2/6異源二聚體在IVD中的作用，以及IVD中機(jī)械拉伸與成骨反應(yīng)之間的因果關(guān)系以及IVD變性的信號(hào)通路。

HCS 上調(diào)人 AF 細(xì)胞中的成骨基因表達(dá)

為了測(cè)試循環(huán)拉伸是否可以啟動(dòng)與IVD成骨相關(guān)的基因表達(dá)，對(duì)人AF細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并接受循環(huán)拉伸方案，其中輕度循環(huán)拉伸（LCS，5%）或高度循環(huán)拉伸（HCS，15%）持續(xù)不同時(shí)間（圖1）。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了HCS處理是否能夠在AF細(xì)胞中誘導(dǎo)Runx2、osterix和OPN表達(dá)。結(jié)果表明，與對(duì)照和LCS處理的細(xì)胞相比，受HCS刺激4 h的AF細(xì)胞顯著誘導(dǎo)Runx2、osterix、OPN 的mRNA（圖1 A）和蛋白質(zhì)（圖1 B）表達(dá)增加。此外，Runx2、osterix、OPN 的mRNA（圖1 C）和蛋白質(zhì)（圖1 D）水平測(cè)定的時(shí)間過程顯示，在HCS處理的AF細(xì)胞中，1小時(shí)內(nèi)升高，并持續(xù)8小時(shí)。

Runx2是成骨基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，因此研究了Runx2是否可以調(diào)節(jié)HCS對(duì)AF細(xì)胞中osterix和OPN表達(dá)的影響。結(jié)果表明，用 Runx2 特異性 siRNA 預(yù)處理細(xì)胞可顯著抑制 HCS 誘導(dǎo)的 osterix 和 OPN 的mRNA 和蛋白質(zhì)在AF細(xì)胞中的表達(dá)，這說明Runx2 參與 HCS 誘導(dǎo)的成骨。

圖1   HCS 上調(diào)人 AF 細(xì)胞中的成骨基因表達(dá)。

BMP-2/6 異源二聚體介導(dǎo)拉伸誘導(dǎo)的成骨基因表達(dá)

BMPs是成骨分化的主要調(diào)節(jié)因子。因此，實(shí)驗(yàn)確定了HCS處理引發(fā)的成骨基因表達(dá)是否會(huì)通過上調(diào)人AF細(xì)胞中的BMPs而產(chǎn)生。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)HCS處理的AF細(xì)胞中BMP-2和BMP-6的mRNA表達(dá)顯著增加（圖2 A）。此外，用針對(duì)BMP-2（Ab-BMP-2）和BMP-6（Ab-BMP-6）的中和抗體預(yù)處理的細(xì)胞顯著抑制了HCS對(duì)AF細(xì)胞中Runx2、osterix和OPN基因（圖2 B）和蛋白質(zhì)（圖2 C）表達(dá)的上調(diào)作用。在重組蛋白實(shí)驗(yàn)中，BMP-2和BMP-6均不能上調(diào)Runx2和osterix的基因和蛋白表達(dá)，而BMP-2/6在相同濃度下誘導(dǎo)Runx2和 osterix 的顯著表達(dá)。這些結(jié)果可推測(cè)，當(dāng)BMP-2或BMP-6的濃度不足以誘導(dǎo)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，BMP-2/6可有效誘導(dǎo)Runx2和osterix表達(dá)。

圖2   BMP-2/6異源二聚體介導(dǎo)拉伸拉伸誘導(dǎo)的成骨基因表達(dá)。

HCS 誘導(dǎo)的 Runx2 表達(dá)依賴于 p38 MAPK

MAPK通路已被證明可以調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過程，包括成骨基因表達(dá)。為了研究MAPKs參與HCS誘導(dǎo)調(diào)節(jié)Runx2表達(dá)的情況，在HCS刺激之前和期間用MAPKs的特異性抑制劑（用于ERK的PD98059，用于JNK的SP600125，用于p38的SB203580）處理人AF細(xì)胞1小時(shí)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SB203580可顯著抑制HCS誘導(dǎo)的Runx2 基因（圖3 A）和蛋白質(zhì)（圖3 B）表達(dá)。HCS誘導(dǎo)后AF細(xì)胞中p38的磷酸化迅速增加，在1-2小時(shí)達(dá)到zui大水平（圖3 C）。此外，與對(duì)照和LCS處理的細(xì)胞相比，受HCS刺激1小時(shí)的細(xì)胞顯著誘導(dǎo)AF細(xì)胞中的p38磷酸化。

圖3   HCS 誘導(dǎo)的 Runx2 表達(dá)依賴于 p38 MAPK。

SAMD1/5/8 參與循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的 Runx2 表達(dá)

將BMP信號(hào)傳輸?shù)郊?xì)胞核所需的SMAD蛋白已被證明可以誘導(dǎo)成骨基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)研究了SMAD1/5/8是否可以調(diào)節(jié)HCS誘導(dǎo)的人AF細(xì)胞中的Runx2表達(dá)。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，HCS處理的AF細(xì)胞的在1小時(shí)內(nèi)顯著誘導(dǎo)SMAD1/5/8 的磷酸化，并持續(xù)8小時(shí)（圖4 A）。與對(duì)照和LCS處理的細(xì)胞相比，由HCS刺激4小時(shí)的人AF細(xì)胞顯著誘導(dǎo)SMAD1/5/8的磷酸化（圖4 B）。用SMAD1特異性siRNA預(yù)處理細(xì)胞顯著抑制HCS處理誘導(dǎo)的Runx2 mRNA（圖4 C）和蛋白質(zhì)（圖4 D）表達(dá)。

圖4   SAMD1/5/8參與HCS誘導(dǎo)的Runx2表達(dá)。

抑制 ALK3 受體降低循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的成骨基因表達(dá)

據(jù)報(bào)道，BMP-2/6異源二聚體可以結(jié)合和激活A(yù)LK3受體，并進(jìn)一步影響宿主細(xì)胞基因的表達(dá)。為了評(píng)估ALK3在HCS刺激的AF細(xì)胞成骨表型中的作用，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了ALK3-siRNA和抑制劑（LDN）對(duì)HCS誘導(dǎo)的人AF細(xì)胞中Runx2和osterix表達(dá)的影響。結(jié)果表明，HCS誘導(dǎo)的Runx2和osterix的mRNA表達(dá)通過ALK3-siRNA或LDN處理顯著降低（圖5 A）。此外，HCS誘導(dǎo)的Runx2和osterix的蛋白表達(dá)在用LDN預(yù)處理的AF細(xì)胞中也被抑制（圖5 B）。此外，在用LDN預(yù)處理的細(xì)胞中，由rhBMP-2/6 異源二聚體刺激的Runx6 mRNA表達(dá)在AF細(xì)胞中受到顯著抑制（圖5 C）。

圖5   抑制ALK3受體可降低HCS誘導(dǎo)的成骨基因表達(dá)。

IVD 損傷患者的成骨基因表達(dá)

圖6 表現(xiàn)為IVD損傷患者手術(shù)切除組織中的成骨基因表達(dá)。退行性IVD和LF組織均表現(xiàn)出成骨表型，這通過Runx2（圖6 A）、osterix（圖6 B）和 OPN （圖6 C）的mRNA表達(dá)的增加證實(shí)。成骨基因在AF組織中的表達(dá)水平高于黃韌帶（LF）組織。

圖6   IVD 損傷患者的成骨基因表達(dá)。

圖7   影響人 AF 細(xì)胞中 15% 循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的 BMP-2/6 表達(dá)和隨后的成骨調(diào)控的可能機(jī)制的示意圖。

總之，該研究結(jié)果提供了有關(guān)HCS誘導(dǎo)人AF細(xì)胞成骨基因表達(dá)的機(jī)制的信息。研究發(fā)現(xiàn)，用HCS刺激人AF細(xì)胞導(dǎo)致BMP-2/6異二聚體介導(dǎo)的信號(hào)通路的激活。抑制ALK3活性可能是控制AF細(xì)胞成骨的有效方法。HCS還誘導(dǎo)p38 MAPK和SMAD1/5/8信號(hào)通路的激活，并最終增強(qiáng)Runx2和osterix在人AF細(xì)胞中的表達(dá)。此外，還發(fā)現(xiàn)人類退行性IVD組織比LF組織具有更高的成骨基因表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)為人類AF細(xì)胞中機(jī)械拉伸和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)相互作用的機(jī)制提供了見解，這可能參與DDD的進(jìn)展，并可用于DDD患者IVD變性的未來治療干預(yù)。

參考文獻(xiàn)：Chen CN, Chang HI, Yen CK, Liu WL, Huang KY. Mechanical Stretch Induced Osteogenesis on Human Annulus Fibrosus Cells through Upregulation of BMP-2/6 Heterodimer and Activation of P38 and SMAD1/5/8 Signaling Pathways. Cells. 2022 Aug 20;11(16):2600. doi: 10.3390/cells11162600. PMID: 36010676; PMCID: PMC9406707.

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