骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、軟骨下骨硬化和骨贅形成為特征的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病。由于軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中的細(xì)胞，軟骨細(xì)胞存活率的下降會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退變。除了遺傳和環(huán)境因素外，機(jī)械應(yīng)力在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。先前的研究報(bào)道，機(jī)械應(yīng)力上調(diào)了一種新型機(jī)械敏感離子通道 Piezo1 在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而增加了軟骨細(xì)胞的凋亡，最終導(dǎo)致軟骨退化。因此，探究參與調(diào)節(jié)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的Piezo1激活過程的分子就尤為關(guān)鍵。

機(jī)械應(yīng)力的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已被廣泛研究。在機(jī)械應(yīng)力下，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)胞內(nèi)相關(guān)分子的活化及對(duì)應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。作為對(duì)機(jī)械應(yīng)力的反應(yīng)，Yes 相關(guān)蛋白（YAP，一種轉(zhuǎn)錄共刺激因子）的亞細(xì)胞定位從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì) YAP 下調(diào) Rho GTPase 酶激活蛋白29（ARHGAP29）的表達(dá)，該蛋白被稱為 RhoA/LIMK/cofilin 通路的調(diào)節(jié)因子。Cofilin 是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。Cofilin 調(diào)節(jié)的聚合肌動(dòng)蛋白增強(qiáng)了 Piezo1 的激活，最終增加了軟骨細(xì)胞的凋亡。然而，機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，特別是上游分子的調(diào)節(jié)，尚未闡明。

雌激素受體包括細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的常規(guī)雌激素受體（ERs）和新型G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（GPERs），它們通過快速非基因組通路和慢速基因組通路發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。雌激素受體調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和代謝，暗示雌激素受體在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的重要作用。先前的研究表明，在雌激素處理后，機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡顯著降低。然而，目前，可能與 OA 發(fā)展有關(guān)的機(jī)械應(yīng)力相關(guān)的雌激素受體類型仍不清楚。

青島大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科及藥劑科、濰坊市中醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科聯(lián)合團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究探討了軟骨細(xì)胞中機(jī)械應(yīng)力相關(guān)的雌激素受體，并試圖辨別與機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的信號(hào)通路密切相關(guān)的雌激素受體類型，并探討它們?cè)?nbsp;OA 過程中對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的潛在影響。

在 Piezo1 沉默后，GPER 在暴露于機(jī)械應(yīng)力的軟骨細(xì)胞中上調(diào)

為了探索與 Piezo1 相互作用的分子和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了轉(zhuǎn)染Piezo1-siRNA后加載機(jī)械應(yīng)力的軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜的變化。在體外多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)中，加載24 h的周期性牽張應(yīng)力，膜性六孔板每孔底部硅膠膜的形變幅度為20％，周期為10次/min。當(dāng)顯著的基因表達(dá)差異被分組并可視化為熱圖時(shí)，沉默 Piezo1 會(huì)導(dǎo)致雌激素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄特征（圖1 a）。進(jìn)一步研究表明，新型雌激素受體 GPER 在 Piezo1 沉默后顯著上調(diào)，而常規(guī) ERα 和 ERβ 沒有顯著變化。疾病和功能分析表明，差異基因主要參與細(xì)胞死亡和存活，表明 Piezo1 參與機(jī)械應(yīng)力對(duì)軟骨細(xì)胞存活的調(diào)控過程（圖1 b）。mRNA表達(dá)測(cè)量確定GPER隨著Piezo1-siRNA的轉(zhuǎn)染而增加（圖1 c）。Weste blot 結(jié)果與 mRNA 表達(dá)一致（圖1 d）。

圖1    在 Piezo1 沉默后，GPER 在暴露于機(jī)械應(yīng)力的軟骨細(xì)胞中上調(diào)。

（a）在暴露于機(jī)械應(yīng)力的軟骨細(xì)胞中 Piezo1 沉默后差異基因表達(dá)值的熱圖。（b）在暴露于機(jī)械應(yīng)力的軟骨細(xì)胞中，Piezo1 沉默后差異基因表達(dá)值的疾病和功能分析。（c）RT-qPCR 分析 Piezo1 沉默軟骨細(xì)胞與非沉默軟骨細(xì)胞中的 GPER 基因。（d）與非沉默軟骨細(xì)胞相比，Piezo1 沉默的軟骨細(xì)胞中 GPER 的蛋白質(zhì)表達(dá)。

GPER 表達(dá)在人骨關(guān)節(jié)炎軟骨中降低

為了探究GPER對(duì)OA的影響，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了OA關(guān)節(jié)軟骨組織和對(duì)照關(guān)節(jié)組織中GPER的mRNA表達(dá)。與對(duì)照組相比，定量 mRNA 表達(dá)顯示，骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中的 GPER 顯著降低（圖2 a）。為了進(jìn)一步證實(shí) GPER 與骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變之間的關(guān)系，通過蛋白質(zhì)印跡法測(cè)量了蛋白質(zhì)水平（圖2 b），并得到一致的結(jié)果。此外還在人軟骨組織中研究了 GPER 表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色和 GPER 的相應(yīng)定量顯示，與對(duì)照軟骨相比，GPER 在退行性軟骨中顯著下調(diào)（圖2 c）。

圖2    GPER 表達(dá)在人骨關(guān)節(jié)炎軟骨中降低。

（a）與對(duì)照軟骨相比，退行性軟骨中 GPER 基因的RT-qPCR 分析。（b）與對(duì)照軟骨相比，退行性軟骨中 GPER 的蛋白質(zhì)表達(dá)。（c）在沒有（對(duì)照）和有抗 GPER 抗體（的情況下對(duì)退行性軟骨和對(duì)照軟骨進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

GPER的激活減少了機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡

細(xì)胞活力和凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2 和 Bax）的表達(dá)用于評(píng)估軟骨細(xì)胞的凋亡。暴露于 24 h 機(jī)械應(yīng)力的軟骨細(xì)胞凋亡增加，其特征是細(xì)胞活力顯著下降、BAX 表達(dá)增加和 Bcl-2 表達(dá)減少。當(dāng)暴露于 24 h 機(jī)械應(yīng)力的軟骨細(xì)胞用 8 μM 雌激素處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡減少。然而，單獨(dú)的雌激素處理并未對(duì)軟骨細(xì)胞存活率產(chǎn)生影響。G15 是 GPER 的抑制劑，減弱了雌激素對(duì)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的抑制作用。這些結(jié)果表明，GPER 而非 ER 介導(dǎo)了雌激素的抗凋亡作用。為了進(jìn)一步證明GPER對(duì)減輕機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用，使用siRNA敲除了GPER。結(jié)果表明，GPER-siRNA有效阻斷了雌激素的抗細(xì)胞凋亡作用，這與抑制劑應(yīng)用的結(jié)果一致。

此外還探討了GPER的特異性激動(dòng)劑G-1 在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡中的潛在作用。單獨(dú)使用 G-1 處理不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡顯著增加。與機(jī)械應(yīng)力組相比，G-1-機(jī)械應(yīng)力組的存活率增加。然后確認(rèn)了 G-1 是否通過 GPER 激活來改善軟骨細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)G-1的抗軟骨細(xì)胞凋亡作用可被有效阻斷。這些結(jié)果說明G-1模擬雌激素的作用降低機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞凋亡。

GPER 抑制機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白聚合和 Piezo1 激活

為了揭示 GPER 在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白聚合和 Piezo1 激活中的作用，用 G-1 或機(jī)械應(yīng)力處理軟骨細(xì)胞。與對(duì)照組相比，機(jī)械應(yīng)力上調(diào)了軟骨細(xì)胞中 Piezo1 的熒光強(qiáng)度。然而，G-1 處理可以顯著減弱該過程中增加的熒光強(qiáng)度（圖3 a）。Piezo1 的激活與肌動(dòng)蛋白聚合密切相關(guān)。為了闡明肌動(dòng)蛋白的作用，用肌動(dòng)蛋白抑制劑 CytoD 處理軟骨細(xì)胞。與機(jī)械應(yīng)力組相比，CytoD 處理的軟骨細(xì)胞中 Piezo1 的表達(dá)降低（圖3 a），細(xì)胞活力和Bcl-2的表達(dá)增加，而BAX的表達(dá)減少（圖3 b、c）。與機(jī)械應(yīng)力處理的細(xì)胞相比，G-1-機(jī)械應(yīng)力處理的軟骨細(xì)胞具有顯著降低的肌動(dòng)蛋白熒光強(qiáng)度（圖3 a），表明 GPER 通過肌動(dòng)蛋白解聚抑制機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的 Piezo1 激活。

圖3    GPER 抑制機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白聚合和 Piezo1 激活。

（a）免疫熒光染色 F-肌動(dòng)蛋白和 Piezo1。（b）用機(jī)械應(yīng)力、10 μM G-1 和 8 μM cytoD 處理的軟骨細(xì)胞的細(xì)胞活力。（c）對(duì)于用機(jī)械應(yīng)力、10 μM G-1 和 8 μM cytoD 處理的軟骨細(xì)胞，Bax 和 Bcl-2 的蛋白質(zhì)表達(dá)。

GPER 通過 YAP-ARHGAP29-RhoA-LIMK-Cofilin 信號(hào)通路調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合

為了確認(rèn) YAP 是否參與機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，使用 siRNA 敲除來抑制 YAP。結(jié)果表明，YAP-siRNA 有效阻斷了 G-1 的抗凋亡作用。這些結(jié)果表明，YAP 在由 G-1 和機(jī)械應(yīng)力調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。此外，探討了 YAP 是否對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合和相關(guān)信號(hào)通路具有潛在的調(diào)節(jié)作用。免疫熒光結(jié)果表明，YAP 沉默有效地減弱了 G-1 誘導(dǎo)的 GPER 激活所導(dǎo)致的肌動(dòng)蛋白解聚和 Piezo1 的失活。作為肌動(dòng)蛋白聚合相關(guān)信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)分子，ARHGAP29通過促進(jìn)與GTP結(jié)合的（活性的）RhoA向其GDP結(jié)合（非活性）形式的轉(zhuǎn)化而降低RhoA的活性，進(jìn)而抑制與肌動(dòng)蛋白聚合密切相關(guān)的LIMK/Cofilin途徑。研究數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組相比，機(jī)械應(yīng)力組ARHGAP29蛋白的表達(dá)明顯降低，RhoA活性、LIMK活性和cofilin磷酸化水平升高，可以通過G-1處理來挽救?？傊?/span>GPER可通過YAP-ARHGAP29-RhoA-LIMK-Cofilin信號(hào)抑制機(jī)械應(yīng)力所致的肌動(dòng)蛋白聚合和Piezo1的激活。

G-1激活的GPER在體內(nèi)抑制關(guān)節(jié)軟骨退化

通過構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨退行性變程度（圖4 a），OARSI 評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)顯示，OA + NC 組的關(guān)節(jié)軟骨退化比 Sham + NC 組更嚴(yán)重，而 G-1 處理減弱了這一病理過程。此外使用了 GPER 和 YAP 的免疫組織化學(xué)染色。如圖4 b，G-1處理可以增強(qiáng)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中YAP的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，關(guān)節(jié)內(nèi)注射 G-1 在體內(nèi)具有潛在的保護(hù)作用。

圖4    G-1 激活的 GPER 在體內(nèi)抑制關(guān)節(jié)軟骨退化。

（a）番紅固綠染色各組關(guān)節(jié)軟骨及OARSI評(píng)分。（b）免疫熒光染色 GPER 和 YAP。

總而言之，該研究通過揭示 GPER 是機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的 Piezo1 激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，并通過 YAP/ARHGAP29/RhoA/LIMK/cofilin 途徑機(jī)械觸發(fā) OA 進(jìn)展過程中的軟骨細(xì)胞凋亡，從而提出了一種新的調(diào)節(jié)和控制機(jī)制，并闡明 GPER 作為 OA 治療靶點(diǎn)的潛在應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：Sun Y, Leng P, Guo P, Gao H, Liu Y, Li C, Li Z, Zhang H. G protein coupled estrogen receptor attenuates mechanical stress-mediated apoptosis of chondrocyte in osteoarthritis via suppression of Piezo1. Mol Med. 2021 Aug 28;27(1):96. doi: 10.1186/s10020-021-00360-w. PMID: 34454425; PMCID: PMC8403401.

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